金银花为常用中药，来源于忍冬科植物忍冬 (Lonicerajaponica Thunb．)的干燥花蕾或带初开的 花，具有清热解毒、散风消肿的功能。中国药典 2000年版一部该品种项下测定绿原酸的含量，2005 年版新增了高效液相色谱法测定有效成分木犀草苷 的含量，而文献报道测定木犀草苷的方法¨ 也主 要是高效液相色谱法，采用c。 柱，流动相分别为乙 腈～0．5％醋酸溶液、乙腈一0．04％ 磷酸溶液、乙腈 一0，5％ 磷酸溶液梯度洗脱；甲醇一乙腈一0．4％ 磷 酸溶液等度洗脱。在样品检验中发现，使用c。 柱测 定时样品色谱图中木犀草苷色谱峰的前后均有小峰 干扰。调整流动相比例亦无法使三者的分离度达到 1．5，不符合药典要求，很难对金银花中所含的木犀 草苷进行准确定量。本文采用C 柱，以0．4％ 磷酸 溶液一四氢呋喃一甲醇(79：1 1：10)为流动相，较好地对金银花中木犀草苷进行分离测定。

关键词：木犀草甙 长沙上禾生物   金银花提取物  含量测定
1 仪器与试药

日本岛津LC一2010高效液相色谱仪，Phenome— flex Luna C8(250 mm×4．6 mm，5 Ixm)，紫外光谱测 定用岛津2550型单光束紫外分光光度仪。

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金银花药材为市场抽验样品(批号：070901， 0700902，070801， 20070818， 070701， 20070401， 070711)。水为去离子水，乙腈、四氢呋喃为色谱 纯，磷酸为分析纯。

2 溶液制备

2．1 对照品溶液 精密称取木犀草苷对照品 21．37 mg，置50 mL棕色量瓶中，加70％ 乙醇制成 427．4 Ixg·mL 对照品储备液。取木犀草苷对照品储备液2 mL于25 mL量瓶中，加70％ 乙醇稀释 至刻度，再取稀释溶液3 mL于10 mL量瓶中，加 70％ 乙醇稀释至刻度，制成10．26 lxg·mL 的对照 品溶液。

2．2 供试品溶液取本品粉末(过4号筛)1 g，精 密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人70％ 乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)1 h，放冷至室温，再称定重量，用70％ 乙醇补 足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3 色谱条件

色谱柱：用辛基硅烷键合硅胶柱Phenomenex Luna—C8(250 mill×4．6 mm，5 lxm)；流动卡目：0．4％ 磷酸溶液一四氢呋喃一甲醇(79：11：10)；流速：1 mL·min～；检测波长为350 nm；柱温：30 cC；进样 量：10 lxL。在本色谱条件下，理论板数以木犀草昔 峰计不低于7000。

4 专属性考察

精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 L， 注人液相色谱仪，记录色谱图，见图1。结果样品色 谱图中木犀草苷峰与前后峰的分离度分别为2．89 和1．99，符合高效液相色谱定量分析的要求。理论 塔板数以木犀草苷计为9000以上。

5 线性关系考察

取浓度为427．4 lxg·mL一的对照品储备液适 量，加70％ 乙醇配制得170．96，85．48，34．192， 17．096，10．2576，8．568，3．4272，1．7138，0．8568 lxg ·mL一的系列对照品溶液，摇匀，分别进样10 L。 以进样量 ( )为横坐标，峰面积积分值y为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为：

Y ：2．465×10 X +2．332×10 r=0．9999

表明木犀草苷进样量在0．86—427．4 lxg的范围内 线性良好。

6 精密度试验

精密吸取对照品溶液(10．26 lxg·mL )10 L，按上述色谱条件，连续进样6次，测得平均峰面 积为934176，RSD为0．71％。结果表明仪器分析的 重复性良好。

7 供试品溶液的稳定性

精密吸取供试品溶液(批号20070401)10 lxL， 分别于0，3，6，9，12，15，18，24 h进样测定，测得样 品中木犀草苷的平均峰面积(n：8)为326649，RSD 为1．2％ 。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

8 重复性试验

取同一批次(批号20070401)的供试品约0．5， 1，1．5 g，精密称定，按“2．1．2”项下方法制备供试品 溶液，进行含量测定。金银花提取物木犀草苷含量的平均值为 0．057％ ，RSD为1．4％ 。结果表明此法重复性良 好。

9 回收率试验

取同一批已知含量(批号20070401)的样品(过 4号筛)0．5 g，共9份，每3份为一组，每组分别精密 加人对照品溶液(427．4 lxg·mL )1．6，2．2，2．8 mL。按“2．1．2”项下方法制备所需溶液，在上述色 谱条件下进行含量测定，计算回收率(n=3)。结果 金银花提取物木犀草苷低、中、高3种浓度的回收率分别为 98．50％ ，99．37％ ，102．76％ ；RSD分别为0．69％ ， 0．16％ 。0．15％ 。

10 样品测定

取不同产地的7批样品各2份，按“2．1．2”项下 方法制备供试品溶液，按上述色谱条件每份溶液分别 进样2次，进行测定，按外标法计算，结果见表1。

l1 讨论

采用C 柱，对流动相进行选择：首先采用中国 药典金银花项下流动相系统(乙腈一0．5％ 醋酸溶 液)，但效果不理想；采用文献报道 的流动相系 统：乙腈一0．04％磷酸溶液、乙腈一0．5％磷酸溶液、 甲醇一乙腈一0．4％磷酸溶液、0．4％磷酸溶液～四 氢呋喃一甲醇，结果目标检测峰木犀草苷与前后峰 的分离度均小于1．5，不符合药典规定。在流动相 系统改变未能达到目的的情况下，实验中纯化供试 品溶液，以期减小其他杂质对目标检测峰的影响：样 品用70％ 乙醇超声提取后蒸干、水溶，分别用乙酸 乙酯、水饱和的正丁醇提取、通过聚酰胺柱洗脱、通 过D101大孔树脂柱洗脱的方法进行纯化，结果未 能得到有效改善，液相色谱图中目标检测峰的分离 度仍然达不到1．5。

进一步对色谱柱进行筛选，分别采用C 柱 (Agilent SB—Cl8；Phenomenex ODS一3；依利特Kro— masil Cl8)、辛基硅烷键合硅胶柱(Phenomenex Luna — C8；Agilent SB—C8)、苯基柱(Agilent SB—Pheny1) 对供试品溶液(按中国药典方法制备)作色谱分离 (采用中国药典金银花项下流动相系统)，结果以C 柱的分离效果较好，目标检测峰的分离度基本达到 1．5；再对流动相系统及供试品溶液制备方法进行优 化，最终确定了采用本文的流动相系统及溶液制备 方法效果最佳。

存在问题：由于目标峰附近的小峰可能与目标 峰化合物结构相似，按照2005年版中国药典规定的方法无法使目标峰呈单峰状态分离，要么与前面小 峰相连，要么与后面小峰相连，以致不能准确定量， 实验中反复筛选，最终选择出能使目标峰与前后小 峰完全分离的条件，即文中叙述条件，存在的缺陷是 保留时间较长，达47．7 rain，这将在我们今后的工作 中进一步研究、改善。

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