番泻叶为豆科(Leguminosae)植物狭叶番泻 (Cassia angustifolia Vah1)及尖叶番泻(Cassia acutifo— lia Delile)的干燥小叶,性寒,味甘、苦。功能泻热行 滞,通便,利水。用于热结积滞,便秘腹痛,水肿胀 满。主要成分是番泻苷A及B、番泻苷C及D、芦荟大黄素双蒽酮苷、芦荟大黄素、大黄酸等。《中国药 典)2005年版一部含量测定项下目前仅是采用分光 光度法测定番泻叶中番泻苷B的含量,但番泻叶中 所含的芦荟大黄素亦有泻下作用 J,故尝试通过 HPLC建立番泻叶中芦荟大黄素的含量测定方法, 以对番泻叶药材内在质量有更加全面的控制,本检 测方法不仅简便、快速、准确性、重现性好,而且更 加稳定。
1 仪器与试药
仪器:WATERS 600-2996高效液相色谱仪。 WATERS 2996检测器,EMPOWER色谱工作站; MILLIPORE公司超纯水制备仪;METI’LER TOLEDO 电子天平;KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器 (功率200 W,频率25 KHz)。
样品:番泻叶由广州奇星药业有限公司提供; 对照品:芦荟大黄素购于长沙上禾生物,纯度为90.4% ,供含量测定用; 试剂:甲醇为色谱纯,其余为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件分析柱为Hypersil ODS2(200 mm ×4.6 mm,5 m);以甲醇-0.2%磷酸溶液(70:30) 为流动相;流速1.0 ml/min;检测波长254 nm;柱温 30~C。理论板数按芦荟大黄素峰计算应不低于 4 000。
2.2 对照品溶液的制备取芦荟大黄素对照品适 量,精密称定,加甲醇制成每1 ml含30 g的溶液, 即得。
2.3 供试品溶液的制备取番泻叶20 g,粉碎,过 3号筛,取2 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加人甲 醇50 ml,称定重量,超声处理30 min,放冷,用甲醇 补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液25 ml,置锥 形瓶中,水浴蒸干,残渣加8% 盐酸溶液15 ml,水浴 加热回流30 min,放冷,加氯仿20 ml,继续加热回流 1 h,立即冷却,转移置分液漏斗中,分取氯仿层,酸 水层再用氯仿振摇提取3次,每次20 ml,合并氯仿 液,80~C水浴蒸干,残渣加甲醇使溶解,转移至20 Hll 量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜 (0.45 Ixm)滤过,取续滤液,即得。
2.4 专属性试验精密吸取对照品溶液、供试品溶 液各10 l,分别注人高效液相色谱仪,按含量测定 的方法测定。结果,供试品溶液色谱中,被测成分 在对照品溶液色谱相应的位置上,有相同的保留时 间的色谱峰。(见图1)。
2.5 线性考察精密称取芦荟大黄素对照品适量, 加甲醇定容至100 ml容量瓶中,超声使完全溶解, 制得芦荟大黄素对照品母液(浓度为0.1549 mg/ m1)。精密量取芦荟大黄素对照品母液1、2、4、6、8、 10 ml,分别置20 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇 匀。分别精密吸取10 ,注入高效液相色谱仪,记 录峰面积,以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘 制标准曲线。回归方程:Y=3.78 X 104X一2.94 X 10— 3X,r=0.999 9,上述结果表明,芦荟大黄素进样量 在7.745—77.45 g范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验精密吸取同一供试品溶液,在上 述色谱条件下连续进样6次,测定芦荟大黄素峰面 积,结果RSD=1.5% 。
2.7 重复性试验精密称取同一批番泻叶样品6 份,按供试品溶液制备方法制备,测定计算,RSD= 2.0% 。结果表明本法重复性良好。
2.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 l,分别在0、2、4、6、8、12 h进样测定,按供试品溶 液中芦荟大黄素含量计算,RSD:0.3% 。结果表 明,供试品溶液在12 h内基本稳定。
2.9 加样回收试验取同一批已知芦荟大黄素含 量的样品(批号6008)6份,每份1 g,分别加入芦荟大黄素对照品母液(83.08 m1)各7.0 ml,挥干溶 剂,按供试品溶液的制备方法制备,测定,平均回收 率为96.13% ,RSD为2.2% 。结果表明本法回收率 比较好。(见表1)。
3 讨论
3.1 检测波长的选择取芦荟大黄素对照品扫描 测定,结果在254 nm处有最大吸收,因此选择254 nm为本品的测定波长。
3.2 色谱条件的考察试验中考察了依利特ODS2 (200 mm X4.6 mm,5 m)、迪马C】8(200 mm X 4.6 mm,5 m)、奥太C18(250 mm X4.6 mm,5 m)3种 品牌的色谱柱测定,结果无明显差异。流动相的考 察参考文献 j,分别用0.1% 、0.2%磷酸溶液与甲 醇混合流动相溶解对照品,结果随磷酸浓度增高, 芦荟大黄素对照品的溶解度增加,因此确定流动相 为以甲醇-0.2% 磷酸溶液(70:30)。柱温的考察, 分别考察了25 oC、30~C、40~C柱温对色谱分离的影 响,在一般情况下,随柱温升高,芦荟大黄素与杂质峰分离度下降,实际检验中应根据样品分离情况在 25cC一40cC范围内选择适宜的柱温。
3.3 超声、和水浴时间的考察,对超声处理20,30, 40 min,和水浴回流15,30,45 min制备的供试品溶 液进行考察。结果显示,超声处理30,40 min,水浴 回流30,45 min结果差异都不大,故选择超声处理 30 min,和水浴回流30 min。芦荟大黄素属于蒽醌 类,遇热易升华 j,故选择氯仿液在80o【=水浴蒸干。
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