大鼠肠道菌群对芹菜素(apigenin)代谢影响 |
发布时间:2014-11-12 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1239 |
摘 要:目的研究大鼠肠道菌群对芹菜素apigenin的代谢影响。方法采用SD大鼠的新鲜粪便,用人工肠液溶解后加入芹菜素apigenin标准溶液,37℃厌氧孵化后采用(RP-HPLC)方法对芹菜素apigenin的代谢情况进行定量分析。结果孵化后1h芹菜素apigenin迅速被肠道菌群代谢,随着孵化时间的延长,芹菜素apigenin被大鼠肠道菌群代谢降解的速度放缓。结论在离体条件下,芹菜素apigenin容易被大鼠肠道菌群代谢。 Metabolism of apigenin by rat intestinal flora Abstract:Objective To study the metabolism of apigenin in vitro intestinal flora from rat.Methods Apigenin was added to the rat fecal flora which was solved in the artificial intestinal juice.The mixture were anaerobically incubated at 37℃,then the metabolism of apigenin was analyzed and quantified by RP-HPLC.Results Apigenin was fast metabolized by rat intestinal flora after incubated 1 h.With the persistence of the incubation time,the speed slowed.Conclusion In vitro,apigenin is easily metabolized by rat intestinal flora. Key words:apigenin;intestinal flora;degradation;HPLC 芹菜素(apigenin)属于黄酮类化合物,广泛存在于水果、 蔬菜、豆类、茶叶中,其中芹菜含量最高。研究发现芹菜素apigenin具 有广泛的药理学作用和生物学特性,如抑制肿瘤、预防高血 压、抗氧化、抗菌、降低肿瘤细胞多耐药性、抗突变等[1】。有观 点认为,芹菜素apigenin的健康促进作用主要依赖于个体摄入量和生 物利用度。为了更好地了解芹菜素apigenin在体内的吸收、分布、代谢 等情况。本研究通过模拟大鼠肠道内环境研究大鼠肠道菌群对 芹菜素apigenin代谢的影响。为其营养学、药理学及开发研究提供依据。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 (1)仪器:Waters2690高效液相色谱检测 仪(HPLC);超纯水器(德国SG公司);高速冷冻离心机(美国 Beckman公司);超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司) GAST真空泵;水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限 公司)。(2)试剂:芹菜素apigenin标准品(美国Sigma公司);甲醇色谱 纯(山东禹王实业有限公司化工分公司);磷酸优级纯(天津科 密欧化学试剂有限公司);水为重蒸水。 1.2 芹菜素apigenin标准贮备液 准确称取芹菜素apigenin标准品50.0 mg,置于50 rrIl容量瓶中。用流动相溶解并稀释定容至刻度,此溶 液为1 mg/ml的芹菜素apigenin标准贮备液,放入4"C冰箱中备用。 1.3 样品预处理 1.3_.1 人工肠液的配制 称取6.8gKH2P04溶解250 ml水 中,加入190ml 0.2mol/L的NaOH和400 ml水,混匀,用0.2 moVL的NaOH调节混合液的pH值至7.5±0.1,加水定容 至1 000 nd。 1.3.2 鼠粪收集 成年SD清洁级大鼠20只,体重180~ 230g,哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供;收 集新鲜鼠粪。准确称量60g。 1.3.3 鼠粪样品的处理 将60 g新鲜鼠粪溶解于180 m1人 工肠液中,用磁力搅拌器搅拌均匀后,用双层纱布过滤,取 18.5 rrIl滤液加入0.27 ml 1 mg/ml芹菜素apigenin标准溶液混匀作为 样品;另取18.5 rrI1人工肠液加入0.27 ml 1 me,/ml芹菜素apigenin标 准溶液混匀作为样品对照;分别取样品和样品对照0.6 m1分 装至2 ml离心管中(样品和样品对照各装30个离心管),充 入c02,封口膜封口。 1.3.4 样品制备与分析 将分装后的离心管于水浴振荡器中 以37’12,80 r/min孵化,孵化前留取0 h样品及0 h人工肠液样 品对照。然后分别留取孵化后1,4,8,24 h的样品和样品对照 (每个时间点样品和样品对照均平行6份)。将样品和样品对照取出后放入一40"C冰箱中保存。分析前先将样品解冻,高速 冷冻离心机4"C,9800 g离心15 min,取上清液,用氮气吹干后 加0.6 ml流动相溶解,取10 进样进行HPLC测定。 1.4 色谱条件 色谱柱为Phenomenex C1R柱(250×4.60 mm,4 m);流动相:甲醇/0.1%磷酸(60/40,v/v);超声波脱 气;流速:1.0 ml/mim;柱温为30"C;检测波长为339 nm;进样 量为10 ;采用等度洗脱。 2 结果 2.1 色谱图(图1,图2) 图1显示,芹菜素apigenin保留时间为 14.040 min。图2显示,芹菜素apigenin与大鼠孵育液中的其他成分 分离完全。
囝1 芹菜素apigenin标准品色谱囝
图2 样品色谱囝 2.2 标准曲线和检测限 以芹菜素apigenin标准贮备液配制0.5,1, 2,4,8,10 ug/ml的标准系列,按色谱条件分别进样,对每一浓 度均求其5次测量的平均值,以峰面积积分值(y)对浓度 (x)进行线性回归,得出直线回归方程Y=37975X一2645, 9。r=0.9995( =5)。线性范围为0.5~10 g/rnl。以3倍 噪音浓度为最低检出限,得芹菜素apigenin的最低检出限浓度为0.11 Ve,/ml。 2.3 精密度实验 取4 g/rnl的芹菜素apigenin标准溶液10 ,按色 谱条件进样,连续进样10次。测得芹菜素apigenin峰面积的相对标准 偏差(RSD)为0.55%,表明仪器进样精密度良好。 2.4 稳定性实验 取预先灭菌的肠道菌孵育液18.5 ml,加 入0.27 mll m/m1芹菜素apigenin标准溶液,样品预处理后按色谱条 件进样,分别测定孵化0,1,4,8,24 h后其中芹菜素apigenin的含量。 测得芹菜素apigenin峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.86%,表明芹菜素apigenin在灭菌的大鼠肠道菌孵育液中24 h内稳定。 2.5 重现性实验 取大鼠肠道菌孵育液18.5 ml,加入0.27 mll mg/ml芹菜素apigenin标准溶液,样品预处理后按色谱条件进样, 测定孵化后4 h的样品中芹菜素apigenin的含量(设6个平行样)。测得芹菜素apigenin峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.78%,表明该方 法的重现性较好。 2.6 回收率实验 取预先灭菌过的大鼠粪便菌孵育液0.5 ml,准确加入1,5,10 g/m1浓度的芹菜素apigenin标准品溶液80 l, 每个浓度平行5份。样品预处理后按色谱条件进样。芹菜素apigenin 的回收率在98.1% ~99.0%之间。 2.7 芹菜素apigenin体外肠道菌代谢 芹菜素apigenin在离体培养的大鼠肠 道菌孵育液中降解较多,在人工肠液中降解较少,而在灭菌后 的大鼠肠道菌育液中几乎无降解,说明肠道菌群影响芹菜素apigenin 的代谢。 3 讨论 肠道菌群对物质的代谢或化学修饰作用国内外研究最多 的是药物,研究多采用高效液相色谱法[ .3],其中整体实验研 究较多,离体实验研究相对较少。有关肠道菌群对黄酮类物 质的代谢目前主要集中在不同膳食类型黄酮类物质吸收代谢 情况的差异[4]、同种类型不同化学结构的黄酮类物质代谢情 况的差异Is3、加入催化反应的酶后黄酮类物质代谢情况的变 化C63、不同黄酮类物质代谢后代谢产物的研究[73等。本研究 发现,在离体条件下,芹菜素apigenin易被大鼠肠道菌群降解,孵化1 h 后芹菜素apigenin迅速被肠道菌群代谢,随着孵化时间的延长,芹菜素apigenin 被大鼠肠道菌群代谢的速度放缓,至24 h后孵育液中芹菜素apigenin 含量最低。另外,在不同环境下,芹菜索降解有较大差异,在 灭菌后的大鼠肠道菌孵育液中几乎无降解,在人工肠液中有 少量降解,在大鼠肠道菌孵育液中降解较多。通过人工肠液 和灭菌后的大鼠肠道菌孵育液作为对照.表明在大鼠肠道菌 孵育液中芹菜素apigenin的降解主要是肠道菌群的作用。通过0 h样 品与1,4,8,24 h样品的比较,表明未经孵化的肠道菌群对芹菜素apigenin无降解作用,而经过水浴振荡器37"(2,80 r/min孵化的肠 道菌群可以对芹菜素apigenin进行代谢降解。 芹菜素优质生产供应商:长沙上禾生物科技有公司 www.staherb.com |