芹菜素又名芹黄素,属于黄酮类化合物,芹菜 素的化学结构为5,7,4 三羟基黄酮,广泛存在 于蔬菜、水果中.其5,7,4 位置的三个羟基和C2, C3双键决定了其独特的药理学效应和生物学特 性.研究表明,芹菜素有降压和影响中枢神经、抑 制致癌物质的致癌活性和保护心脏的作用,可用 于治疗帕金森氏症,也可以作为抗HIV抗病毒药 物及MAP激酶的抑制剂,及消炎作用等 4。
目前测定芹菜素的方法主要有毛细管电泳 法 、反相高效液相色谱法 j、毛细管电泳~ 电 化学检测法 和铝显色分光光度法¨ 等,荧光光 度法尚未见报道.本研究旨在利用芹菜素对丹酰氯的荧光猝灭作用,建立荧光猝灭法测定芹菜中 芹菜素的新方法.一般而言,荧光猝灭法比直接荧 光测定法更为灵敏,具有更高的选择性
1 实验部分
1.1 主要仪器和试剂
RF5310型荧光光度计(日本岛津公司);F一 4500型荧光光度计(日本日立公司). 芹菜素(金测分析技术有限公司)标准溶液: 3.700×10~mol/L,溶剂为6o% 乙醇溶液;丹酰氯 (DNS—C1,Alfa Aesar 10141137)溶液:0.05 g/L,溶剂 为60% 乙醇溶液. 所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水.
1.2实验方法
于10 mL具塞比色管中,依次加入0.05 g/L 丹酰氯溶液0.25 mL、pH 7.00 Tris—HC1缓冲溶 液2.0 mL和一定体积的芹菜素标准溶液,60% 乙醇定容至5.00 mL,20 oC放置10 min;220—650 nm波长范围内荧光光谱扫描,激发和发射狭缝宽 度始终为10 Nm.并在A =320 nln,A =480 am 处,测定溶液的荧光强度 和 (试剂空白),以 △F(AF=Fo一,)对芹菜素物质的量浓度进行线 性回归.
2 结果与讨论
2.1 光谱特征
2.1.1 三维荧光光谱
图1~图3分别为芹菜素、DNS—C1、芹菜素 与DNS—C1结合后的三维荧光光谱图.由图1可 见,芹菜素在乙醇溶液中并不具有荧光现象,而 DNS—cl溶液( 图2)在A =320 nm,A。 = 480 nm处有很强的荧光.从图3可知,随着芹菜素 的加入,DNS—C1在A :480 am处的荧光峰明显下降,这可能是DNS—C1与芹菜素发生了结 合,形成酚酯产物 .
2.1.2 荧光光谱
DNS—C1的荧光强度随芹菜素含量的增加而 逐渐减弱,在A :480 nm处的荧光强度减弱程 度与芹菜素含量有良好的线性关系,如图4(曲线 1~6),因此选择A =480 am作为测量波长.
2.2 结合比推导
DNS—CI与芹菜提取物芹菜素的结合受很多因素影响, 而结合常数可反应主客体的结合力度.Benesi— Hildebrand[1 法是利用光谱法来测定主客体结 合物形成常数的最经典的方法. 如果DNS—C1与芹菜素形成1:1结合物,则 可表示为: JK. DNS—C1+Cl5H1o05 DNS —C1·C】5H1o05 荧光强度变化值F同芹菜素浓度的关系为: 1 l F Fo—F 1 l 丽 丽+ 百 丽 (1) 如果DNS—C1与芹菜素形成1:2结合物,则 可以表示为: . DNS—C1+C15H1005 DNS—C1·2C15Hlo0s 荧光强度变化值F同芹菜素浓度的关系为: 1 l AF Fo—F 一— — — — — — — — — — — — — — — — — — — 一 — — — — — — 一 Kl [DNS—C1][cl5HloO5] [C15H1oO5] (2) 式中,F, 分别为芹菜素浓度为一定值和为零时 溶液的荧光强度, 为常数,K.为结合常数,[DNS — c1]为DNS—C1的浓度,[C15H。。05]为c H o05 的浓度.
由式(1)可知,若1/ △F对l/[C H。。0 ]作 图得一直线,则结合比为1:1.由式(2)可知,若1 /△F对1/[c H 。05] 作图得一直线,则结合比为1:2.如图5所示,我们可以看到1/ △F与1/ [c, H 。0 ]有很好的相关性(R=0.996 3).因此, 我们认为DNS—C1与芹菜素的结合比为1:1.
2.3 试剂用量选择
2.3.1 缓冲液类型及其酸碱度和用量的选择 分别试验了pH值为4.0、4.8、5.6的HAc— NaAc缓冲液和pH值为7.00、7.50、8.00、8.40、 9.00的Tris—HC1缓冲液对体系荧光猝灭程度的 影响.发现体系在pH 7.00~8.【)(】的Tris—HC1缓 冲液中F值最大.故实验选择pH=7.50的Tris— HC1溶液作为体系的缓冲试剂.通过Tris—HC1缓 冲液的用量实验发现,其适宜用量范围为1.5~ 2.5 mL,超出该范围时F值出现降低.这可能是 用量不足时,Tris—HC1缓冲效果不好;当Tfis— HC1缓冲液加入量过高时,反而抑制了芹菜提取物芹菜素与丹酰氯的作用,使F值降低.实验选择pH 7.50的 Tris—HC1缓冲液用量为2.00 mL.
2.3.2 DNS—C1乙醇溶液用量的选择
DNS—C1乙醇溶液的适宜用量范围为0.10— 0.30 mL,超出该范围时F值明显降低.这可能是 DNS—C1用量不足时,酚酯产物太少,荧光猝灭程 度低;而当DNS—CI用量过高时,抑制了酚酯的 自聚作用,使荧光猝灭程度降低.实验表明加入 DNS—C1用量在0.25 mL时,F出现最大值,故选 择加入0.05 g/L的DNS—CI乙醇溶液0.25 mL.
2.3.3 反应时间与温度的选择
实验表明,体系在试剂完全混合后迅速反应, 室温放置10 min后体系的荧光值达到最大,且2 h 内体系荧光值基本保持不变.本文选择体系反应 10 min后测定.
考察了反应温度在15~35℃ 时对体系荧光 猝灭程度的影响.温度高于25℃ 时,猝灭强度变 化值F随着温度的升高而减小,可能原因是升温时分子热运动增加,分子间作用力和疏水作用减 弱,导致分子复合物稳定性降低;当温度低于 15℃时,空白荧光值较小,F变化不大,可能是低 温条件下,反应太慢.故实验选择室温(约20c{:) 下反应10 rain后测定.
2.3.4 试剂加入顺序的影响
在已优化的试验条件下,分别1)芹菜提取物芹菜素一一+ Tris—HGl缓冲液_.+DNS—cl;2)DNS—c Tds— HCI缓冲液一芹菜素;3)芹菜素一DNS—C1 Tris — HCI缓冲液;三种顺序加人试剂.结果表明,按 顺序2)加入试剂出现的 值最大,故确定2)为 本实验试剂加入顺序.
2.4 干扰试验
考察了蔬菜中可能存在的干扰物质对测定结 果的影响.当相对误差控制在±5% 以内时: 1 000倍量的Na 、c 、Ban、C1一、NO;、NO;、草 酸;100倍量的SO 、K 、甲醇、丙酮,均不干扰 测定.同为黄酮类物质的槲皮素、芦丁对本实验是 有干扰的,但一般芹菜中的槲皮素、芦丁相对芹菜提取物芹菜 素来说,含量少,对测定的干扰可以忽略不计.
2.5 方法线性范围、检出限和精密度
在优化的实验条件下,向体系中加入不同量 的芹菜素标准溶液按1.2实验方法操作,DNS— Cl荧光猝灭程度(AF)与芹菜素在6.40 X 10一 mol/L一5.92 X 10 mol/L浓度范围内呈现 良好的线性关系,回归方程为△,= 112.18 C 。 (×10 mol/L)一1.25,相关系数为0.9989.按实 验方法进行11次空白值测定,按C =3Sb/k(Sb 表示标准偏差,k表示校准曲线的斜率)计算检出 限为1.92 X 10~mol/L.
测定溶液中芹菜素含量分别为3.0 X 10 tool/L(低浓度)、3.0 x 10 mol/L(中浓度) 和5.0 X 10 mol/L(高浓度),各作9份平行实 验,计算得相对标准偏差分别为4.2% 、3.9% 和 2.4 % .
3 样品分析
将市售芹菜除去非食用部分,称取4.O0 g样 本参照文献[17]处理,制得样品分析溶液.取样 品分析溶液1.O0 mL按1.2实验方法进行测定, 结果如表1.
4 小结
由实验可知,在pH 7.50 Tifs—HC1缓冲液 中,芹菜提取物芹菜素与DNS—C1作用,在A :480 nm处产 生荧光猝灭,DNS—C1荧光猝灭程度与加入芹菜 素的量在一定范围内呈良好的线性关系,据此建 立荧光猝灭法测定蔬菜中芹菜素含量的新方法. 该方法简单快速用于实际样品的分析,结果满意. |