厚朴提取物长期灌胃对小鼠肾脏的损害作用 |
发布时间:2013-12-19 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2238 |
[摘 要] 目的:观察长期服用厚朴甲醇提取物对小鼠肾脏的损害作用。方法:厚朴提取物混悬液0.5 ml/鼠(相当于原药材0.25 g)给小鼠灌胃,每天1次,于给药后0、1、2、3个月时称体重;用RP-HPLC法测定24 h尿、血、肾脏厚朴酚、和厚朴酚量;检查肾功能指标并行肾组织病理学检查。另设生理盐水、空白混悬液对照组。结果:小鼠体重未见明显改变,药物在肾脏排出的半衰期增加1 h以上,血清肌酐、尿素氮和补体3及尿蛋白均增加,病理学检查有明显病理改变。结论:长期服用厚朴对小鼠肾脏具有损害作用,肾损害程度与鼠体内厚朴酚、和厚朴酚的浓度呈正相关。 [关键词] 厚朴;厚朴酚;和厚朴酚;肾损害 厚朴为木兰科植物厚朴(Mangnolia officinalis Rehd.et Wils.)或凹叶厚朴(Mangnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)的干皮、根皮及枝皮,主要成分为厚朴酚(magnolol)、和厚朴酚(honokiol)及四氢厚朴酚、异厚朴酚等,药理作用和临床应用广泛。近年临床应用中发现,长期(30 d以上,剂量不等,一般在每天5~10 g原药)应用含厚朴制剂或药方的病人发生肾脏可逆性损害,其发生率和损害程度明显高于不用或短期应用者。本文观察了小鼠长期给厚朴提取物后肾脏的损害过程和程度,为探索厚朴制剂致病人肾损害的原因寻找实验依据。 1 材料和方法 1.1 仪器和试药 高效液相色谱系统:510泵、490E检测器、Baseline 810工作站(Waters公司);4mm×250 mm色谱柱及预柱(中科院大连化学物理研究所);AT-130柱控温系统(天津金洲科学仪器公司)。厚朴酚、和厚朴酚对照品(中国药品生物制品检定所);川厚朴(山东省医药公司);有关试剂为色谱纯和分析纯。 1.2 动物 成年昆明种小鼠(山东省医学科学院试验动物中心),♀♂兼用、分笼饲养,平均体重(20.1±3.2) g,实验期间正常饮食和饮水。 1.3 方法 1.3.1 制备厚朴制剂 取川厚朴50 g,粉碎后用甲醇浸泡24 h×2次,合并浸出液,滤清后50℃水浴中减压浓缩,流浸膏用淀粉吸收后搓成颗粒,晾干,研磨成细粉,按重量10∶1加CMC-Na,研匀,以乙醇-水(1∶5)为溶媒制成混悬液100 ml,每1 ml相当于原药材0.5 g,用RP-HPLC法测定含量,厚朴酚12.15 mg/ml,和厚朴酚4.11 mg/ml。同时制备不含厚朴甲醇浸出物的空白混悬液。 1.3.2 RP-HPLC条件[2,3] 柱填料Spherisorb C18(10μm),预柱填料YWG C18;流动相甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1),流速1.2 ml/min;检测波长294nm,灵敏度0.005 AUFS;柱温40℃。 1.3.3 分组与给药方法 取3组小鼠,采用等容积法(0.5 ml·次-1·d-1)分别每日晨空腹灌胃生理盐水、空白混悬液或川厚朴提取物混悬液0.5 ml(相当于原药材0.25 g),每天1次,分别于单次给药后、连续给药1、2和3个月时称体重并收集24 h尿,经眼眶静脉取血,然后处死小鼠取出肾脏(每组随机取10只,♀♂各半)备用。同时另取两组对照组小鼠,与给药组一起进行相应处置。 1.4 样品处理与测定 尿:记录24 h各时间段尿液体积和总体积后,取样2 ml,加入30%三氯乙酸溶液0.1 ml,离心沉淀蛋白质后取上清液测定厚朴酚、和厚朴酚含量;另取尿液测定有关肾脏功能生化指标。血清:取眼眶血,待凝后4 000 r/min离心10min,分离血清0.5 ml,加入甲醇0.5 ml沉淀蛋白质,离心,精取上清液0.5 ml,加入0.1 mol/L的冰醋酸溶液0.1 ml,摇匀,用乙酸乙酯-乙醚混合液(1∶1)2 ml萃取,离心后取有机相1 ml置尖底试管中,45℃水浴中冷氮气流吹干,加入流动相0.1 ml溶解后进样20μl,测定厚朴酚、和厚朴酚含量;另取血样测定有关肾脏功能生化指标。肾:按2 ml/g组织加入生理盐水制成匀浆,后处理方法同血清。用RP-HPLC法测定肾组织中厚朴酚、和厚朴酚含量,并行病理学检查。 2 结 果 2.1 RP-HPLC法测定结果 待测样品的色谱行为良好,与生物性杂质实现完全分离,厚朴酚、和厚朴酚的保留时间分别为6.43和8.44 min。尿、血清和肾样品中厚朴酚在0.05~2 mg/L、和厚朴酚在0.025~1 mg/L浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好。同一浓度样品连续测定5次的日内RSD均<5%、连续测定5 d的日间RSD<7%,平均加样回收率>90%。厚朴酚、和厚朴酚的最低检测浓度在血、尿样中分别为0.01和0.008 mg/L。 2.2 体重变化 长时间连续给药后,小鼠体重与对照组相比未见明显变化(P>0.05),但体重增长速度略慢,结果见表1。 2.3 体液中药物含量与动力学参数变化 长时间连续给药后,厚朴酚、和厚朴酚的血药浓度均随时间延长而增加,表明药物在体内有蓄积现象;24 h尿药浓度则逐渐下降,说明尿中排出减少;而肾组织中蓄积量亦呈逐渐增加趋势,结果见表2。各时间段尿药浓度用3P87药动学程序拟合,主要尿药动力学参数见表3。两种药物在大鼠体内代谢均符合一级消除动力学二室开放模型,药物在肾脏的排出半衰期增加了1 h以上。 2.4 肾脏功能生化指标变化 连续给药后,血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白蛋白和补体3(C3)均呈增加趋势,补体4(C4)未见明显改变。24 h尿蛋白增加明显,空白混悬液和生理盐水组相应值没有增加,可以说明肾脏功能变化应是由厚朴所引起。结果见表4。 2.5 肾脏细胞结构病理学变化 结果见图1。可见灌胃生理盐水3个月后肾组织呈正常结构,空白混悬液组3个月后肾小球有轻度肿胀、肾小管上皮细胞正常、球囊稍扩大、肾小管内可见少量炎性渗出,应为混悬液中所含乙醇所致;厚朴灌胃1个月后,肾小球轻度肿胀,肾小管(右上方)上皮肿胀、肾小管轻度扩张、部分肾小管内可见沉积物;3个月后肾小球肿胀、呈网状、结构消失,肾小球内可见少量沉积物,肾小管上皮多呈立方状结构。 3 讨 论 厚朴是一味传统中药,应用广泛。《中华人民共和国药典》2000年版记述其归脾、肺、大肠经,有关传统著述尚未见对肾脏正负面作用的记载。据该药物出口东南亚国家反馈信息“长期使用本药的病人肾功能有不同程度损害”。调查本院临床,确有此损害发生,但为可逆性损害。本实验研究表明,小鼠长期口服厚朴提取物(主要成分为厚朴酚、和厚朴酚)确实存在肾脏的损害,包括血清Cr和BUN等指标的明显变化和光镜下组织学的改变,组织学改变情况与IgA肾病模型相似,如肾小球内沉淀主要在系膜区呈颗粒或团块状,肾小球肿大,并有炎细胞浸润。临床含厚朴方主要用于消化系疾病,一般用量为5~10 g(中华人民共和国药典2000年版载用量为3~9 g)。按照人标准体重70 kg、小鼠20 g,设计每只小鼠给药剂量为每次相当于原药材150、200和250 mg的提取液。预实验表明小鼠对最大剂量耐受性良好,并且给予这个剂量时血、尿中厚朴酚、和厚朴酚浓度方能同时测定,故选择250 mg作为单次给药剂量。因本实验旨在初步观察长期给药后肾损害的现象,应观察在连续给药过程中的累积毒性,故设计了1、2、3个月的给药疗程详细的剂量-损害、时间-损害、不同周龄动物、不同种类动物的肾损害,对抗这种损害的药物或活性化合物的筛选实验仍在进行中。 本文对厚朴酚、和厚朴酚动物体内药动学研究发现,药物的生物利用度很低,大部分药物经肠道排泄,肾脏排泄率只有30%左右。虽然如此,但是本实验表明,长期给药后在肾脏有蓄积中毒作用,体内药物浓度升高,消除半衰期延长,但对厚朴长期应用后的肾脏损害机制尚不明,有待进一步的实验研究。综合本实验结果表明,长期应用厚朴对肾脏确有损害作用,提示临床应用该药物时,应尽量减少使用时间。如必需长期应用,则应定期检查肾功能,或者与肾功能保护药物联用。 厚朴酚、和厚朴酚为同分异构体,分子中均有两个酚羟基,含厚朴制剂中的厚朴酚、和厚朴酚HPLC测定法一般在常温下用甲醇+水或乙腈+水作流动相,药物保留时间过长,完成一次测定需时15~20 min,本实验在流动相中加入冰醋酸调节pH,使药物呈完整的分子状态,加上使柱温升高,药物保留时间缩短,完成一次测定只需10 min。 |