茶氨酸和厚朴提取物对7日龄小鸡分离应激反应 |
发布时间:2013-12-19 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1907 |
[摘要] 目的:研究茶氨酸对7日龄小鸡应激反应的影响,与厚朴提取物(25 mg·kg-1)合用是否具有协同作用。方法:茶氨酸(12·5, 25, 50 mg·kg-1腹腔注射30 min后,记录分离小鸡和未分离小鸡自主活动、分离发声和福尔马林诱导的疼痛反应的影响。结果:茶氨酸3个剂量和厚朴提取物(25 mg·kg-1)能显著减轻分离小鸡的悲鸣(P<0·05,P<0·01);茶氨酸25, 50 mg·kg-1对分离应激引起的痛觉钝抑(analgesia)有对抗作用。各组对自主活动均无明显影响。结论:茶氨酸与厚朴单独应用可以缓解小鸡分离应激反应,提示对紧张、焦虑和抑郁症有潜的治疗作用。不同剂量茶氨酸与厚朴提取物25 mg·kg-1合用协同作用不明显。 [关键词] 应激;茶氨酸;厚朴提取物; 7日龄小鸡;分离试验 现代社会中,应激(stress)是许多疾病的基本发生因素,如高血压、肿瘤和情感性疾病等。随着社会压力的逐渐增大,应激诱发的疾病逐年增加。应激是指机体受到各种内外环境因素刺激时所出现的非特异性全身反应,引起应激的“应激源”包括生理因素、环境因素及心理文化因素,其主要特征为机体受到刺激后发生肾上腺垂体下丘脑活性增强,伴有神经、内分泌和行为等变化。 茶氨酸(theanine,系统命名为N-乙基-Cl-谷氨酰胺,cl-glutamylethylamide)是茶叶中特有的一种氨基酸。1950年由日本首次从茶叶中提取,并确定了其化学结构。茶氨酸具有多种生物学活性:如降低血压、直接和间接的抗肿瘤作用、缓解紧张、提高学习及记忆能力等。据国外临床验证服用茶氨酸,对慢性应激引起的抑郁和焦虑有一定的防治效果。 厚朴Magnolia officinalisRehd etW ils属木兰科木兰属乔木,其树皮为我国传统芳香化湿类中药。主要含厚朴酚、和厚朴酚及生物碱等成分。含有厚朴的汤剂在临床上治疗精神焦虑、抑郁等具有很好疗效,引起广泛关注。 本试验的目的在于观察茶氨酸对小鸡分离应激和疼痛模型的影响,同时检测茶氨酸与厚朴提取物合用是否具有增强作用。 1 材料和方法 1.1 动物 北农大3号小型粉壳商品代雄性雏鸡,中国农业大学动物科技学院北农大种禽公司提供。参照《用户手册》其生活习性接近自然。 1.2 药品 茶氨酸(Thea, 99%,批号20060316),厚朴提取物(HE,类白色半结晶状物,批号20060612,厚朴酚与和厚朴酚为80% )均由美国TG Biotek, LLL公司提供。 1.3 仪器、试剂 程控自主活动箱ZIL2(中国医学科学院药物研究所研制),直径30 cm,内装4个红外线探头,记录小鸡自主活动状况。电子天平(G& GT-200型,常州)。乙醇、甲醛均为分析纯(北京化工厂,20040718)。 1.4 方法 小鸡孵出1 d后,放于动物盒中,半开放式立体笼养, 25只/盒。每日喂食6次,自由进食与饮水。室温(26±1)℃。湿度(50±10)%。自然光和人工光照相结合,光照时间为15 h·d-1,成活率95%。每日更换垫料,小鸡从一个盒子换入另一个盒子时,用手轻触小鸡,使其适应,以减少未来实验引起的过度反应。连续喂养7 d,第8 d开始试验。 1.4.1 分组 本实验分组为2水平(分离与未分离)3因素(剂量分别为12·5, 25, 50 mg·kg-1,约为人的4~16倍)设计,每组动物20只。Thea溶解于生理盐水中。HE先用乙醇少量溶解,缓慢加入生理盐水至所需浓度。试验开始前30 min腹腔注射给药, 2μL·g-1,以等量溶媒为对照。 1.4.2 自主活动 实验中,分离组小鸡每次1只单独放入自主活动箱。未分离组小鸡每次1只放入自主活动箱的同时,将另外3只小鸡一起放在活动箱的侧部,使其可以清楚地看到自己的同伴。PC专用程序分别记录每只小鸡3 min的活动次数。 1.4.3 分离发声(separation vocalization)试验 用OlympusWS-100数字声音记录仪记录各组小鸡鸣叫,每只3 min。记录仪麦克风置于小鸡头部8cm处。声音记录后存入计算机。利用音频处理软件(Cool edit pro 2·0),对小鸡叫声进行峰值频率(PF)和声强(dB)分析[57]。 1.4.4 疼痛试验 用微量注射器将0·1%福尔马林注入小鸡足跖, 50μL/只。观察小鸡对福尔马林的反应,记录小鸡的抬脚次数、抬脚时间(Hughes&Sufka, 1991, Sufka&Weed, 1994)和啄脚次数。 1.5 统计学处理 数据表示成-x±s,用SPSS软件(12·0版)进行t检验和方差分析。 2 结果 2.1 Thea和HE提取物对小鸡自主活动和分离发声的影响雄性小鸡,随机分为9组:Thea低、中、高剂量组(12·5, 25, 50 mg·kg-1);HE(25 mg·kg-1),不同剂量Thea加HE组(25 mg·kg-1)。记录各组自主活动和分离发声情况(表1)。 结果表明,在实验剂量下,Thea对自主活动没有影响,HE对小鸡自主活动虽有轻度抑制,但无显著性差异。分离发声的检测表明,分离组小鸡与未分离组小鸡相比,频率改变不明显,但叫声明显增强(dB负值减小,P<0·01),说明分离应激可以使叫声增强。给药后鸣叫强度减小(P<0·05,P<0·01)。而与分离对照组相比,二药合用以后dB不变而随着Thea浓度增加PF有减小趋势,需要进一步试验证实。由于药物对自主活动均无明显影响,在此剂量下不具有镇静作用,说明小鸡发声强度减少与镇静作用无关。 2.2 Thea对福尔马林诱导的足跖疼痛的影响 分组同前。观察福尔马林致痛后3 min小鸡的行为表现。注射福尔马林引起小鸡炎性疼痛。分离组小鸡疼痛钝抑(stressinduced analgesia),疼痛持续时间明显减少(P<0·01),说明分离应激使疼痛感觉减弱。Thea于25 mg·kg-1和50 mg·kg-1单独应用,可以增加抬脚持续时间,提高疼痛感觉(P<0·05),说明其有对抗分离应激导致疼痛减弱的作用。HE(25 mg·kg-1)单独应用对疼痛减弱反应没有影响[9]。从本实验检测来看,不同剂量的Thea合用HE(25 mg·kg-1)对此模型协同作用不明显(表2)。 3 讨论 本实验的目的是观察药物对小鸡分离应激行为的影响。离开群体可以使小鸡分离发声增加而对福尔马林引起的疼痛感觉减弱。分离模型(separationmodels)包括灵长类动物的母子分离、群居动物的孤养等。研究表明,动物母子分离后出现激越、哀鸣等特征性表现。最有价值的分离动物模型是除人类之外的灵长类。然而由于稀少和昂贵,很少有人用其进行药物筛选或作用机制的研究。事实上,许多动物如猫、狗、鼠和鸡等都会因为与群体隔离出现绝望现象。其中,小鸡分离模型(separation model inchicken)是最典型的抗议绝望(protestdespair)模型。孵出1周的小鸡,单独隔离,开始是困苦鸣叫(shrill calls termed distress vocalization test 1985,Gardner),频度很高,典型者1 h后减低。抗焦虑药、抗抑郁药等均能明显影响困苦鸣叫的时间;而抗胆碱药和中枢兴奋药则无效。 在小鸡分离应激的行为改变(Frohm &Wallnau, 1983; Gallup & Suarez, 1980; Jones& Harvey,1987; Jones&Mery, 1988)中,分离发声(Meeker&Bean, 1980)和痛觉消失(Sufka& Hughers, 1991,1994)是最常用的两个指标。分离发声方法比较简单,但需要摄像机、声音接收系统和PC分析程序,限制了其应用。近年来随着医学科学的发展,特别是分子生物学、医学影像、PC程序的应用,为应激等研究提供了新方法、新思路。与生物工程系合作,利用音频处理软件Cool editpro2·0中的频谱分析,对小鸡叫声进行峰值频率(PF)分析。峰值频率是在一段音频频谱中声强值最高处的音频频率值,为反映该音频信号特性的指标之一。此外,峰值频率对应的强度值可以表示为小鸡叫声在这个频率上所占成份最多,因此也可把声强(dB)值作为分析比较的一种途径。结果表明,在本实验条件下,分离组小鸡比未分离组小鸡的鸣叫在声强(db)上差别明显(P<0·01)。说明分离应激使小鸡叫声增强。不同剂量的Thea和HE单独应用对小鸡分离发声有明显抑制(P<0·05,P<0·01),具有潜在的抗焦虑作用。同时对自主活动没影响,不具有镇静催眠特性。这些药理学特征正是人们所期待的。结合临床病人用药习惯,动物试验多采用灌胃给药,我们采用腹腔注射主要是在尽可能排除药物影响的同时观察方法的可行性。 应激、焦虑和抑郁是当前医学生物学和社会科学研究的热点之一。利用天然植物制剂改善这些症状已成为国际上的流行趋势。Thea对中枢的作用机制可能与其竞争谷氨酸受体,抑制谷氨酸的兴奋毒性有关。此外,Thea还能增加纹状体的多巴胺浓度、减少5-HT的合成[14]。这些神经递质与精神和行为活动密切相关。厚朴资源丰富,其主要成分厚朴酚与和厚朴酚(0·2~0·5 mg·kg-1)对小鼠有明显的抗焦虑作用。Thea和HE均具有心境稳定(a feeling ofwelbeing),舒缓紧张(physicalandmental relaxation)的药理作用,且无明显的不良反应,有望成为不错的中药制剂。 研究发现雏鸡和哺乳动物的学习记忆机制、情绪机制有很多相似之处,并在相关的脑结构及功能上具有一定的可比性。这在一定程度上为研究人的学习、记忆、情绪反应提供了参考。参照国外方法,研究了Thea和HE对小鸡分离应激行为的影响,为其临床应用提供了初步数据。 |