摘要：目的：比较不同产地夏枯草中抗非小细胞肺癌活性成分科罗索酸的含量差异。方法：通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）和吖啶橙（AO）/溴化乙啶（EB），评价科罗索酸对非小细胞肺癌细胞的增殖抑制以及凋亡作用；建立高效液相色谱法，比较14个产地夏枯草中科罗酸的含量差异。结果：科罗索酸抑制SPC-A-1人非小细胞肺癌的生长增殖（IC50=1.05×10-6mol/L），并且诱导SPC-A-1细胞凋亡。14个产地夏枯草中科罗索酸的含量差异较大，山西产地的含量最高，河南-2产地的含量最低。结论：科罗索酸为夏枯草的抗非小细胞肺癌的活性成分，不同产地夏枯草的科罗索酸含量差异较大。

关键词：夏枯草；科罗索酸；四甲基偶氮唑蓝；凋亡；高效液相色谱法；产地；质量

中药质量控制是中药现代化的重要问题，涉及到原药材、中间品、成药以及生产中的各个环节。现行的中药评价模式主要是通过光谱、色谱技术对中药整体性评价。但是，中药具有能防治治疗疾病的特点，对于具体的某一病症，其药效物质基础是不一致的。在目前对中药的质量控制中，多采用具体的指标，但是此指标是否是此中药治疗具体病症的药效物质基础，这方面研究显示出众多的缺陷与不足。中药的质量控制应对具体的病症以具体的指标来评价。

夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的花穗，在我国有着悠久的药用历史，为《神农本草经》收录，具有清肝、明目、止痛之功效。临床上用用于目赤肿痛、高血压、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛等症。研究表明夏枯草具有降血压，抗肿瘤，抗炎等活性。夏枯草含有多种活性成分，主要包括酚酸、三萜、多糖、黄酮等。在笔者前期的研究中，夏枯草提取物显示出较强的抗非小细胞肺癌活性。初步研究结果显示其药效物质基础与三萜类成分有关，其中主要以齐墩果酸和熊果酸为主要指标进行了质量差异评价。科罗索酸为其主要的萜类成分之一，最新研究发现其也具有抗肿瘤活性。

在具体的活性方面，中药的质量评价应基于与此药效物质基础相关的活性成分来进行评价。在本研究中，对夏枯草中科罗索酸进行了抗非小细胞肺癌的活性评价，采用高效液相色谱法，分析比较不同产地夏枯草属药材科罗索酸含量的差异，为更好控制夏枯草的质量提供实验依据。

材料

1. 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪，DAD检测器；BP-211D分析电子天平（德国Sartorius公司，十万分之一）。BUCHI Rotavapor R-220旋转蒸发仪（瑞士），DZF-6051型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；荧光显微镜（Olympus IX71倒置荧光显微镜奥林巴斯BX51，日本）。酶联分析仪为SPECTRAmax 190（Moleculor Devices，USA）。

2. 试药科罗索酸对照品（上海顺勃生物工程技术有限公司，批号：080420，含量≥98%）。药材购自广州药店，经本实验室鉴定为Prunella vulgaris L。水为双蒸水。甲醇、磷酸（TEDIA，色谱醇）。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、溴化乙啶（EB）和吖啶橙（AO）为Sigma公司产品。其他试剂为分析纯。SPC-A-1人非小细胞肺癌细胞株（以下简称“SPC-A-1细胞”），购自中国科学院上海细胞库。

方法与结果

1. 科罗索酸对SPC-A-1细胞生长抑制作用 取对数生长期SPC-A-1细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配成3×104/mL的单细胞悬液接种于96孔板中，每孔100μL。实验组加90μL不含牛血清的培养基，另加入科罗索酸10μL，使其最终浓度分别为10×10-6、5×10-6、1×10-6、0.2×10-6、0.04×10-6、0.008×10-6、0.0016×10-6mol/L。阳性对照组加10×10-6mol/L 5-氟尿嘧啶（5-Fu），空白对照组加100μL培养基代替。每组设6个平行孔，另设本底对照孔（等体积含相应浓度药物的无细胞培养液），置于37℃ 5%CO2培养箱中培养36h，每孔加入MTT液10μL，培养4h，弃去每孔中的液体，每孔加DMSO 100μL，振荡10min后置于580nm波长酶联免疫检测仪测定OD值，计算生长抑制率（按以下公式），求IC50值。以上实验重复3次。

细胞生长抑制率=（对照组OD均值-实验组OD均值）/对照组OD均值×100%

表1结果显示，10×10-6mol/L科罗索酸对SPC-A-1细胞生长抑制率为84.66%。经SPSS软件统计分析结果显示其IC50=1.05×10-6mol/L。结果表明，科罗索酸具有较强的抑制SPC-A-1细胞增殖活性。

2. 科罗索酸对SPC-A-1细胞凋亡的影响 取对数生长期SPC-A-1细胞接种于包被多聚赖氨酸的玻片上，于24孔板中孵育。待细胞长至80%融合度时，细胞给予1×10-6、0.2×10-6、0.04×10-6mol/L的科罗索酸，按“1.”项条件孵育48h。取出玻片，PBS溶液润洗，然后用AO/EB溶液细胞染色，并于荧光显微镜（Olympus IX71倒置荧光显微镜奥林巴斯BX51，日本）观察拍照。细胞凋亡率评价根据绿色（正常）或玛瑙色（凋亡）彩色面积，应用Image-Pro Plus picture分析软件计算凋亡率。

表2结果显示1×10-6、0.2×10-6、0.04×10-6mol/L科罗索酸组细胞的凋亡率分别为28.97%±4.41%、15.33%±0.97%、5.13%±0.97%。研究结果表明科罗索酸具有诱导SPC-A-1细胞凋亡活性。

3. 科罗索酸分析方法的建立

3.1 色谱条件色谱柱：ZORBAX C18（2.1mm×100mm，3μm），检测波长215nm，柱温30℃，进样量2μL，流动相为乙腈-水（85:15），流速为0.2mL/min。在此分析条件下，样品中科罗索酸与其他色谱峰有较好的分离度（＞1.5），峰形对称。色谱图见图1。

3.2 供试品溶液的制备取夏枯草药材，100℃烘干，粉碎机粉碎，粉末过40目筛。精密称取1.0g样品粉末，置100mL具塞圆底烧瓶中，加入无水甲醇，回流提取2次（2h/次，每次20mL），合并滤液，60℃条件下于旋转蒸发仪中回收甲醇，残渣用无水甲醇定容至10mL瓶中，过0.45μm 滤膜，即得样品溶液。

3.3 标准曲线的制备精密称取科罗索酸对照品适量，加无水甲醇溶解，配制成0.550mg/mL

的对照品溶液10mL，备用。取对照品溶液，依次稀释成68.8、34.4、17.2、8.6、4.3μg/mL浓度，分别进样分析，测定其峰面积。以峰面积为纵坐标进行线性回归，得科罗索酸的回归方程、相关系数、线性范围分别为Y=36.334X+18.819（R2=0.9998），在4.29-68.75μg/mL的进样量范围内，与峰面积具有良好的线性关系。

3.4 精密度实验取同一夏枯草样品溶液，连续进样6次，记录保留时间及峰面积，计算科罗索酸保留时间和峰面积的RSD值分别为0.46%和2.07%。结果表明，仪器精密度良好。

3.5 重复性实验取同一样品粉末，按供试品溶液制备方法分别制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算科罗索酸保留时间和峰面积的RSD值分别为0.13%和2.54%。结果表明，方法重复性良好。

3.6 稳定性实验取同一样品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定。科罗索酸保留时间和峰面积的RSD值分别为0.39%和1.54%。结果表明，品在24h内稳定。

3.7 加样回收率精密称取已知含量的夏枯草提取物粉末6份，分别置100mL具塞圆底烧瓶中，各精密加入137.5μg/mL科罗索酸0.8mL。结果科罗索酸平均回收率98.00%，RSD值为1.28%（见表3）。

4. 不同产地夏枯草中科罗索酸含量比较取不同产地夏枯草属药材粉末1.0g，精密称取，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，测定不同产地夏枯草中科罗索酸的含量。从表4中可以看出，不同产地的夏枯草中科罗索酸含量存在着较大差异。山西产地药材中科罗索酸含量最高，为（355.84±3.21）μg/g生药；河南-2批次药材科罗索酸含量最低，为（61.40±2.37）μg/g生药。对于不同河南产地的药材，不同批次之间也存在这接近1倍的含量差异。

讨论

夏枯草作为一味抗肿瘤中药，在中医临床中得到普遍的应用。在笔者过往的研究中发现夏枯草具有体内外抗非小细胞肺癌SPC-A-1活性，其中萜类为其最主要的活性成分。科罗索酸为夏枯草中重要的活性成分，能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和调节细胞周期。本研究结果显示科罗索酸具有抑制SPC-A-1细胞增殖和诱导凋亡活性。科罗索酸为夏枯草抗非小细胞肺癌的药效物质基础成分。所以，在抗肺癌活性方面，科罗索酸应作为指标

性成分之一来对夏枯草的质量加以控制。

本研究通过体外细胞实验，得出科罗索酸具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用。再此基础上确认其为夏枯草中抗肿瘤的活性成分，进而以此为控制指标，对市场上流通的夏枯草药材进行质量控制。目前，对于中药材的质量控制，最大的缺点是药

效与控制指标之间的相关性缺失，无法科学有效的控制其质量。市场上流通的不同的夏枯草抗非小细胞肺癌的活性存在着很大差异，其内在原因在于其药效物质基础的差异。研究结果表明，虽同为市场上流通的药材，但是其科罗索酸含量存在着差异。

本研究中，流动相组成的选择分别考察：乙腈-水；甲醇-水；甲醇-0.1%磷酸；乙腈-0.1%冰醋酸；甲醇-0.1%冰醋酸溶液梯度洗脱。通过比较发现甲醇-0.1%磷酸流动相使目标峰与其他峰较好分离，分离度较好，无其他峰干扰，且分析稳定，故选择甲醇-0.1%磷酸为流动相。另外，本研究分别考察了215，230，254，280，330nm波长对色谱峰分离的影响。从研究结果看，215nm波长为最佳检测波长。本研究建立的分析方法，准确、快速、简便、可行，可用于不同产地夏枯草的科罗索酸含量差异的比较测定，能为夏枯草的质量控制提供参考依据。