芹菜素对人急性髓性白血病细胞化疗敏感性的增强作用 |
发布时间:2013-12-11 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1224 |
摘 要:目的:观察芹菜素(API)能否增强人急性髓性白血病(HL-60)细胞系细胞对顺铂(DDP)的化疗敏感性。方法:取对数生长期的HL-60细胞,分为API组、DDP组、API+DDP组与空白对照组。API组加入API,终浓度为1.0μmol·L^-1,DDP组加入DDP,终浓度分别为1.0mg·L^-1,2.0mg·L^-1,4.0mg·L^-1,API+DDP组API终浓度为1.0μmol·L^-1,DDP分别为1.0mg·L^-1,2.0mg·L^-1和4.0mg·L^-1,空白对照组仅加入等量完全培养基。采用MTT比色法测定细胞生长抑制率。另取对数生长期的HL-60细胞,分组同上,采用流式细胞术测定细胞凋亡率。另取对数生长期的HL-60细胞,分为3组,前2组加入1.0μmol·L^-1API,分别培养24h,48h,对照组仅加入等量完全培养基,采用间接免疫荧光标记流式细胞术观察API对HL-60细胞NF-κB和Bcl-2表达的影响。结果:1.0μmol·L^-1API无细胞毒作用,不能有效诱导HL-60细胞的凋亡,但它与不同浓度的DDP合用,可增强DDP对HL-60细胞增殖的抑制作用,并使细胞凋亡率明显增加。1.0μmol·L^-1API可抑制HL-60细胞NF-κB和Bcl-2的表达(P均〈0.01)。结论:API可增强DDP对HL-60细胞增殖的抑制作用和诱导凋亡作用,其机制可能与下调NF-κB和Bcl-2的表达有关。 关键词:人急性髓性白血病 芹菜素 顺铂 凋亡 Chemosensitization effects of apigenin on cisplatin in human acute myeloid leukaemia HL-60 cells Abstract:Aim : To observe the chemosensitization effects of apigenin (API) on cisplatin (DDP) in human acute myeloid leukaemia HL-60 cells. Methods: Ⅰ : HL-60 cells were allocated into API group, DDP groups, API + DDP groups, and control group. API group was given 1.0 μmg·L^-1 API, DDP groups were given 1.0 mg·L^-1 DDP, 2.0 mg · L^-1 DDP,4.0 mg · L^-1 DDP,respectively, and API + DDP groups were given 1.0 μmol · L^-1 API plus 1.0 mg · L^-1 DDP,2.0 mg· L^-1 DDP,4.0 mg · L^-1 DDP, respectively. Control group was only given culture fluid. The inhibition rate of cell growth was detected using MTT assay, Ⅱ - HL-60 cells were allocated as above method and the apoptosis rate was determined using flow cytometry. Ⅲ : HL-60 cells were allocated into API groups and control group. API groups were given 1.0 μmol·L^-1 API and cultured for 24 h, 48 h, respectively, and the control group was only given culture fluid. The expressions of NF-κB and Bcl-2 in HL-60 cells were detected using immunofluorescence flow cytometry. Results: 1.0 μmol · L^-1 API had no cytotoxic effects on HL-60 cells and did not induce cell apoptosis but after being combined with DDP, the inhibition rate and the apoptosis rate increased, and the expressions of NF-κB and Bcl-2 were downregulated compared with DDP groups. Conclusion: API promotes proliferative inhibition and apoptotic induction of HL-60 cells by DDP, which may associate with its downregulating the expressions of NF-κB and Bcl-2 protein. Key words:human acute myeloid leukaemia ; apigenin ; cisplatin ; apoptosis 多酚类黄酮化合物芹菜素(4 5,7一三羟基黄酮, API)具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗高血压、镇静等作用。其中,以抗肿瘤作用最为突出,研究表明, API可抑制黑色素瘤的生长、侵人和转移⋯ ;能选择性诱导前列腺肿瘤细胞的凋亡 。 ,对甲状腺癌细胞 生长有明显的抑制作用 引,可诱导人急性髓性白血 病HL-60细胞凋亡 。为探讨API的化疗增敏作用, 作者观察了API对顺铂(DDP)抑制HL-60细胞增殖 和凋亡的影响。 1 材料与方法 1.1 药物与试剂 注射用DDP为齐鲁制药有限公司产品。API为美国Sigma公司产品。FITC标记山 羊抗鼠IgG、TRITC标记兔抗山羊IgG 由Santa Cruz 公司生产;NF.KB山羊抗人多克隆抗体为TBD Science 产品.Bcl-2鼠抗人单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品。 1.2 细胞培养 HL-60细胞系细胞购自中国典型 培养物保藏中心(武汉市),用含体积分数10%小牛 血清(FCS)的RPMI 1640培养基在体积分数5% CO ,37℃ ,饱和湿度的细胞培养箱内培养,2~3 d 传代1次,取对数生长期细胞用于实验。 1.3 细胞增殖活性测定 取对数生长期的HL-60 细胞以5×l0 /孑L接种于96孑L板,分为API组、DDP 组、API+DDP组与空白对照组。API组加入API, 调整终浓度为1.0 gmol·L~,DDP组加入DDP,调 整终浓度分别为 1.0 mg·L~,2.0 mg·L~,和4.0 mg·L~,API+DDP组加入API和DDP,使API最 终浓度为1.0 m01.L~,DDP分别为1.0 mg· L~,2.0 mg·L 和4.0 mg·L~,空白对照组仅加 入等量完全培养基,每组设4个复孑L。培养48 h 后,各组每孑L均加入10 L 5 g/L MTT溶液,继续培 养6 h,1000 r/min离心,吸去培养基后每孔加入100 L二甲基亚砜溶液,振荡,用酶联免疫仪检测各孔 在490 nm波长下的吸光度(A),计算细胞的生长抑 制率(IR ):IR: (1一用药组A值/对照组A值) ×100% 。合并用药效果根据文献[7]求出q值,当 q<0.85时,表示2药合用有拮抗作用;q>1.15时, 表示有增效作用;1.15≥q≥0.85时,表示有相加作 用。以上实验重复3次。 1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期 的HL-60细胞,离心弃去旧培养基,接种于5O ml培 养瓶中,每瓶4.5 ml细胞悬液,含HL-60细胞4× l0。个。分组同1.3。培养48 h后,收集约10。个细 胞,PBS洗2遍,弃上清液,用体积分数75% 的乙醇 固定,过夜,PBS洗3次后,经0.5 g·L 的RnaseA 消化30 min,用终浓度为65 mg·L 的碘化丙锭染 色1 h后流式细胞仪(FACS420型)测定,计算细胞 凋亡率 引。 1.5 间接免疫荧光标记流式细胞术检测NF-KB和 Be!-2蛋白表达 取对数生长期细胞,离心弃去旧培 养基,接种于培养瓶中,每瓶4.5 mL细胞悬液,含 HL-60细胞4×10。个。加入0.5 mL 1.0 ptmol· L~API,分别培养24 h、48 h,同时设空白对照组 (含等量完全培养基),每组设3个复孔。收集约 l0 个细胞,PBS洗2遍,弃上清液,用预冷的体积分 数75% 乙醇4℃ 固定,过夜。测定时洗去乙醇,加 入1:100稀释的PPARr山羊抗人多克隆抗体或 bc1.2鼠抗人单克隆抗体,4℃ 冰浴1 h,充分洗涤, 加入二抗TRITC标记兔抗山羊Ig G或羊抗鼠FITCIgG, 4℃ 暗处孵育30 min,上机检测,采用EXP032 Software计数10 000个细胞中的阳性细胞,计算阳 性细胞百分率。 1.6 统计学处理 采用SPSS 11.0软件行方差分 析,检验水准Ot=0.05 2 结果 2.1 API对DDP抑制HL-60细胞增殖及凋亡的 影响 1.0 m0l·L API无细胞毒作用,不能有效 诱导HL-60细胞的凋亡,但它与不同浓度的DDP合 用,可增强DDP对HL-60细胞增殖的抑制作用,并 使细胞凋亡率明显增加(q>1.15)。见表1、2。 表1 API对DDP抑制HL-60细胞增殖的影响 API为1.0 lrmol·L一 表2 API对DDP诱导HL-60细胞凋亡的影响 API为1.0 ptmo|·L一 2.2 API对HL.1;0细胞NF-KB与Bcl-2蛋白表达 的影响 1.0/~mol·L API作用24 h、48 h可抑制 HL-60细胞NF.KB和Bcl-2蛋白的表达(表3)。 表3 API对HL-60细胞NF-KB及Bcl-2蛋白表达的影响 与空白对照组相比,P<0.0 3 讨论 目前对于API抑制肿瘤细胞增殖作用的研究主要集中在其对细胞周期的影响上。G。期细胞能否 进入S期以及细胞能否由G 期过渡到M期是细胞 周期能否正常运行的2个关键步骤。有研究显示 API可通过降低cyclinB1及CDK1的蛋白水平,抑 制CDK1激酶活性引起细胞G:/M 期阻滞 。 。另 有研究表明,API的另一抗肿瘤作用与诱导肿瘤细 胞凋亡有关,其诱导凋亡的机制可能是通过细胞色 素C 的释放及天冬氨酸特异性半胱氨酸酶 (caspase.9、caspase.3)的激活而实现的 川。此 外,API也可以通过激活P53/WAF1途径发挥抗肿 瘤作用,API能使肿瘤细胞内P53蛋白、P21/WAF1 蛋白水平升高,2者可使细胞周期发生阻滞,并通过 P53途径诱导肿瘤细胞凋亡¨ ” 。另有研究显示, 核因子.KB(NF.KB)的活化能阻止caspase.8活化, 并引起凋亡抑制剂蛋白的表达。API能够抑制NFKB 和Bcl-2蛋白的表达,使Bax/Bcl-2的比值发生 转变,最终诱导凋亡的发生. 本实验结果显示:1.0 tLmol/L的API可增强 DDP对HL-60细胞增殖的抑制作用,提示API可能 具有HL-60化疗增敏的全新适应证。本实验结果 还显示:1.0 tLmol/L的API能促进DDP诱导的HL- 60细胞凋亡,下调HL-60细胞NF-KB和Bcl-2蛋白 的表达,提示低浓度的API可降低HL-60细胞对化 疗药物诱导凋亡的抗性,其机制可能与下调NF-KB 和Bcl-2的表达有关。 |