芹菜素对大鼠生精细胞凋亡作用的影响 |
发布时间:2013-12-11 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1302 |
摘 要:目的研究芹菜素对大鼠生精细胞凋亡的影响。方法应用percoll不连续密度梯度分离培养大鼠睾丸生精细胞,应用流式细胞术观察芹菜素对生精细胞凋亡的影响。结果芹菜素作用于大鼠生精细胞,FCM分析显示芹菜素能促进生精细胞凋亡,并呈剂量依赖方式。结论芹菜素能呈剂量依赖式促进睾丸生精细胞凋亡。 关键词:芹菜素 生精细胞 细胞培养 凋亡 The Research on the Apoptosis Effects of Apigenin on the Spermatogenic Cells of Rats Abstract:Objective To investigate the apoptosis effects of apigenin ( certain phytoestrogens) on the spermatogenic cells of rats. Methods Using the technique of Percoll discontinuous density gradients centrifugation, the higher purity of spermatogenic cells were primary cultured. The different concentrations of apigenin were used on spermatogenic cells to observe the apoptosis of sperematogenic cells by using the technigue of flowcytometry. Results It was indicated that apigenin promoted the apoptosis rate of spermatogenic cells in dose-dependence. Conclusions Apigenin could inhibit the reproduction of spermatogenic cells and promoted their apoptosis. Key words:apigenin; spermatogenic cells; cells culture; apoptosis 芹菜素对作为一种黄酮类化合物,有镇静、安 神、抑制肿瘤物质、降压、抗氧化、抗菌等多种生 物学作用。有研究表明芹菜素对前列腺癌CA— HPV一10细胞有明显的诱导凋亡作用,而对NHPE 和PZ—HPV一7细胞则无诱导凋亡的作用 J。这 说明芹菜素抑制肿瘤作用不但通过直接抑制细胞生 长而且还通过选择性诱导肿瘤细胞凋亡来发挥作 用。但在芹菜素影响肿瘤细胞增殖及凋亡的同时, 是否对正常细胞也有作用,此方面的研究较少。本 研究采用体外细胞培养大鼠生精细胞的方法观察芹菜素对生精细胞的作用,以探讨芹菜素对雄性大鼠生殖系统的作用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 成年健康Sprague—Dawley雄性 大鼠,体重250~300g,由辽宁医学院实验动物中 心提供。 1.1.2 实验试剂 高糖DMEM (Sigma公司),1:250胰蛋白酶(Sigma公司),芹菜素(陕西慧 科),percol1分离液(Phamacia公司),AV—PI双 染凋亡试剂盒。 1.2 方法 1.2.1 Percoll不连续密度梯度离心液的制备 将无菌的纯Percoll液用PBS液稀释,分别配 成22%、30% 、40%、50%、60% 的浓度液体待 用 J。将上述浓度的离心液按60%、50%、40% 、 30% 、22%浓度顺序各2ml加入到lOml圆底离心 管中,形成一个五层不连续密度梯度的离心液备 用。 1.2.2 生精细胞的制备 大鼠清醒状态下断颈处死后,于无菌条件下取 出睾丸,立即用含100 IU/ml青霉素的Hank’S液冲 洗3次,冲净血污后,浸入冰的DMEM培养液中 (含250 IU/ml青霉素,0.5mg/ml链霉素, lOmmoL/L Hepes,pH7.4,10%小牛血清)去除被 膜,将睾丸组织剪成(1~2)mm 小块,放人 DMEM培养液中,静置5min,吸去DMEM培养液,放人0.25%的胰蛋白酶消化液中(体积为组织的 30~50倍),摇匀后放人37℃的水浴箱中消化,并 不时震荡15min,小牛血清中止消化,取悬液,将 未消化完全的组织重复上面过程再消化1次,将几 次消化后的细胞悬液用100 目的铜网过滤, 1000rmp离心5min;弃上清,用2ml的DMEM重 新悬起。 1.2.3 生精细胞的不连续密度梯度离心法分离提 纯 粗制的细胞悬液加到预制的Percoll密度梯度 离心液上,1500rmp离心25min,于第二层(30% 浓度)得到提纯的生精细胞,可用长的带有斜口的 针头的注射器轻轻吸取,吸取细胞的过程中,切勿 混杂其它分离层的液体。 1.2.4 细胞计数 取0.1ml 0.4%台盼蓝和0.9ml 细胞悬液,立即置显微镜下计数,分别检测细胞存 活率。 1.2.5 生精细胞的体外培养 将提纯的细胞加人培养液DMEM培养液中, 制成密度为3×10 /ml的细胞悬液,接种在无菌的 6孔培养板内(预敷多聚赖氨酸),每孔5ml,放人 CO 孵箱内孵化。每24h在倒置显微镜下观察各孔 培养细胞的形态,然后更换新的培养液。 1.2.6 应用流式细胞术检测细胞凋亡状况 细胞以3×10 /ml密度接种于六孔培养板内, 细胞培养24h后,吸出板内液体,换成含不同浓度 芹菜素的培养液。 一组:生精细胞组(空白对照组);二组:生 精细胞+芹菜素(10 M);三组:生精细胞+芹 菜素(10 M);四组:生精细胞+芹菜素(10 M);五组:生精细胞+芹菜素(10 M)。 每组设4个平行孔,继续培养24h后,吸出孔 内液体,加人0.25% 的胰蛋白酶,消化3~5min 后,小牛血清中止消化,收集细胞悬液,lO00rmp 离心5min,弃上清,用PBS (pH7.2)悬起, 1000g离心5min,弃上清,PBS (pH7.2)悬起, 细胞计数,细胞数达到(1~5) ×10。个,离心 1000rmp,5min,弃上清,将细胞重悬于2001xl的 Binding Buffer中,加人101xl Annexin V—FITC和 5 l PI,轻轻混匀,避光室温反应15min。加人 3001xl的Binding Bufer,在1h内上机检测。 1.2.7 数据处理 数据以均值±标准差( ±s) 表示,数据的统计学分析采用单因素方差分析及q 检验。 2 结 果 实验中每份样本检测1×10 个l~2_k细胞,由 计算机测量细胞凋亡率,如表1。 表1 芹菜素对大鼠生精细胞凋亡的影响(工± ) 注:Api为芹菜素,与空白组比较。P<0.05 二组与三组比较,三组与四组比较,均有显著 性差异(P<0.05),结果显示生精细胞的凋亡率 在芹菜素浓度为10一~10 M 问呈剂量依赖性。 空白组生精细胞的凋亡率明显低于给药组,有显著 性差异(P<0.05)。10 M组细胞凋亡率与10 M组无显著性差异,但是死亡率高于其它各组。 这说明芹菜素对大鼠生精细胞凋亡有促进作用并呈 剂量依赖性,高浓度芹菜素对细胞产生细胞毒性作 用。 不同浓度芹菜素对生精细胞凋亡作用的AV— PI双染流式结果见图1。 3 讨 论 有研究表明,芹菜素通过提高细胞内活性氧水 平,改变线粒体跨膜电位促使细胞色素C释放到 胞浆并激活Capase一9的作用,进而导致细胞内 Caspase一3蛋白酶活化,引起细胞凋亡 。有文献 表明,芹菜素通过下调细胞周期蛋白Bl(eyelin B1)的表达及降低eyelinB1结合的周期蛋白细胞 依赖激酶CDK1活性将癌细胞阻滞在G2M期 。 芹菜素诱导凋亡的机制还可能是通过激活P53/wafl 途径发挥诱导凋亡作用。芹菜素能使肿瘤细胞内 P53蛋白、P21/wafl蛋白水平升高,二者可以使细 胞周期发生阻滞,并通过P53途径诱导肿瘤细胞凋 亡 。此外,核因子一kB (NF—kB)、B淋巴细 胞瘤/白血病(Bel一2)、Bax(Bel一2的家族成 员)也参与了芹菜素的诱导肿瘤细胞凋亡作用。 NF—kB的活化能阻止处于切冬酶级联反应顶端的 Capase一8活化,并引起凋亡抑制剂蛋白(IAP)的表 达,使Bax、Bel一2的比值发生转变,最终诱导凋亡 的发生 J。本实验中采用流式细胞仪结合Annexin V FITC/P I检测生精细胞凋亡情况,发现生精细胞 的凋亡率随着芹菜素浓度的增高而增高。芹菜素对体外培养的生精细胞有促进其凋亡作用,并在芹菜素浓度10~~l0-SM浓度问成剂量依赖性。 |