芹菜素诱导人胃癌细胞凋亡作用及机制研究 |
发布时间:2013-12-11 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1232 |
摘 要:目的:研究芹菜素(apigenin,API)致人胃癌细胞凋亡作用及其机制。方法:培养人胃癌BGC823细胞株,加入不同浓度的API,孵育48h。PI染色流式细胞术(FCM)分析测定凋亡率;罗丹明染色FCM分析测定细胞线粒体跨膜电位(△φm);Caspase-9分光光度法检测试剂盒测定caspase-9活性;Western印迹检测线粒体凋亡信号转导通路相关蛋白的表达,包括bax,bcl-2,caspase-9和caspase-3。结果:API(20,40和80μg/mL)作用48h能呈浓度依赖性地诱导BGC823细胞凋亡。而且,API也能降低BGC823细胞的aCm,增加caspase-9活性,促进细胞色素c(Cytc)释放,上调bax。caspase-9和caspase-3蛋白的表达,同时下调bcl-2蛋白表达,且呈剂量依赖性。结论:API通过活化线粒体信号转导途径诱导人胃癌细胞凋亡。 关键词:胃肿瘤 芹菜素 凋亡 线粒体跨膜电位 caspase Study on pro-apoptotic effect of apigenin on human gastric cancer cells and its underlying mechanisms Abstract:Objective To determine the effect of apigenin (API) on induction of apoptotic death in human gastric cancer cells and its underlying mechanisms. Methods Human gastric cancer BGC823 cells line was cultured and treated with different concentrations of API for 48 h. Cell apoptosis and mitochondrial membrane potential was determined by flow cytometery (FCM) labeled with propidium iodide (PI) and Rhodamine123, respectively. Caspase-9 activity was determined by caspase-9 colorimetric assay kit. Western blot was used to analyze the expressions of apoptosis mitochondrial signal transduction pathway related proteins including bax, bcl-2, caspase-9 and caspase-3. Results Treatment with API (20, 40 and 80 μg/mL) for 48 h could concentration-dependently induce the apoptotic death of BGC823 cells. Moreover, API could also decrease the cellular △φm, increase the activity of caspase-9 and enhance the releasing of cytochrome c. The protein expressions of bax, caspase-9 and caspase-3 were upregulated by treatment with API, associated with a downregulation of the protein expression of bcl-2. Conclusion API can induce the apoptosis of human gastric cancer cells via activating mitochondrial signal transdution pathway. Key words:gastric cancer; apigenin ; apoptosis ; mitochondrial membrane potential ; caspase 芹菜素(5,7,4’.三羟基黄酮;apigenin, API)是一种分布广泛的黄酮类化合物,API在 体外能够显著抑制白血病、结肠癌、乳腺癌、黑 色素瘤以及前列腺癌等肿瘤细胞的增殖作用。 其作用机制主要包括以下几个方面:(1)诱导 细胞凋亡:API通过提高细胞内活性氧水平,降 低线粒体跨膜电位促使细胞色素C释放并激活 capase.9的作用,进而导致细胞内caspase一3蛋白 酶活化,引起细胞凋亡¨刮;(2)细胞周期阻滞: API通过下调细胞周期蛋白B1(cyclin B1)的表 达及降低cyclin 131结合的周期蛋白依赖激酶 CDK1活性将结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤细胞阻 滞在G:/M期 J。然而在人前列腺癌LNCaP细 胞经API作用后细胞周期被阻滞在G。/G.期, 这是由于API可下调细胞cyclin D1,D2和cyclin E以及通过p53途径上调CDK 抑制因子 p2 1 WAF1和p27 KIP1表达,从而抑制了CDK2, CDK4,CDK6活性 ;(3)促进癌细胞分化:API 可促进HL260细胞向单核细胞分化。 细胞凋亡的调控根据其起始信号的细胞部 位不同,主要有2条诱导途径:死亡受体途径和 线粒体途径,不同的死亡信号通过不同的途径 诱导细胞凋亡。最近的研究表明线粒体是细胞 内死亡信号的重要感受器与放大器,在细胞凋 亡早期,核染色体DNA还未改变之前,已出现 结构和功能的变化,说明线粒体在细胞凋亡调 控过程中起重要作用 。有研究表明API经线 粒体途径诱导急性髓性白血病细胞凋亡¨ 。本 研究旨在验证API是否通过活化线粒体信号转 导通路诱导人胃癌BGC823细胞凋亡。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 Apigenin购自Sigma公司, RPMI.1640培养液购自Gibco公司,新生牛血清 购自杭州四季青生物工程公司,罗丹明1 23, caspase.9分光光度法检测试剂盒购自南京凯基 生物公司,caspase.9抑制剂(Ac.LEHD.CHO)购 自Alexis公司,bcl一2,bax,cyt c,caspase一9, caspase一3和13一actin抗体购自Santa Cruz公司,辣 根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗均购 自武汉博士德公司。 1.2 细胞培养 人胃癌细胞株BGC823由 中科院上海细胞生物学研究所引进。用含有 10%小牛血清、1O0 U/mL青霉素和1O0 Ixg/mL 链霉素的RPMI.1 640培养液,在37℃ ,含5% CO 的饱和湿度的培养箱内培养传代。 1.3 PI染色流式细胞术测定细胞凋亡率 收集PBS,API(20,40,80 Ixg/mL)作用48 h后 的细胞2.0×1 0。个,用4℃ 预冷体积分数为 0.75的乙醇固定细胞,加入碘化丙啶(PI)均匀 染色,30 min后用流式细胞仪检测凋亡率。 1.4 细胞线粒体跨膜电位(A,m)检测 收 集PBS,API(20,40,80 Ixg/mL)和API 40 g/mL 加Ac.LEHD.CHO作用48 h后细胞2.0×10。 个,用PBS洗涤细胞2次,重悬于罗丹明1 23染 色液(终浓度5 t~g/rnL)中,于37℃避光孵育30 min,再用PBS洗涤细胞2次,利用流式细胞仪 以罗丹明1 23为荧光指示剂检测细胞线粒体 △ m 的改变。罗丹明1 23 的激发波长为 475 nm,发射波长为525 nm。 1.5 Caspase一9活性测定 取未处理和经药 物处理48 h的细胞3×1 0。~5×1 0。个,按 caspase.9分光光度法检测试剂盒说明书进行操 作,即用50 L冰冷Lysis Buffer悬浮细胞,置冰 上20 min;4℃ 离心(1 0 000 r/min)3 min,把离 心上清转移至新的管中,置冰上;用BCA蛋白定 量试剂盒测定蛋白浓度;吸取50 L含50~ 200 g蛋白的细胞裂解上清;如体积不足50 IxL 用Lysis Buffer补足至总体积50 IxL;加入50 L 的2×Reaction Buffer(使用前每50 L 2×Reac— tion Buffer加入0.5 IxL DTl");加入5 IxL caspase一 9底物并于37℃ 避光孵育4 h;用酶标仪在 )L=405 nm测定其吸光值。通过计算OD诱 / OD刚 a的倍数来确定凋亡诱导剂组caspase一9 的活化程度。以Lysis Buffer和Reaetion Butier混 合物作为参比。 1,6 Western印迹分析 收集I X 1 0。以上细 胞,2 500 r/min离心10 min,冰PBS洗2次,加 入1 00 IxL细胞裂解液(1 0 retool/L Tris.C1 pH 8,0,1 retool/L EDTA ,20% SDS,5 mmol/L DTr 和10 retool/L PMSF)于冰上裂解1 h, 12 000 r/rain离心5 min,收集上清。Lowry法测定蛋白含量。加入2O L的5×上样缓冲液 (250 mmol/L Tris-HCI pH6.8,10% SDS,50% 甘油,0.5% 溴酚蓝,5% 二巯基乙醇),加热变 性。用1 0% SDS.聚丙烯酰胺凝胶(检测Cyt C 时用1 5% )电泳分离蛋白质。凝胶上的蛋白带 转移到PVDF膜上,封闭液封闭膜上的蛋白结合 位点2 h。加入一抗(bcl-2,bax,caspase-9, caspase.3,Cyt C,1:200;B.actin,1:400),4℃ 孵育 过夜;加相应辣根过氧化物酶标记的二抗 (1:2 000),37℃孵育1 h。ECL检测,扫描。 收集细胞(1×10 /mL),于冰浴预冷的匀浆 缓冲液(250 mmol/L Sucrose,20 mmol/L Hepes/ KOH ,pH7.5,1 0 mmol/L KCI,1.5 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTI’,0.1 mmol/L PMSF)"400 L重悬,移入玻璃匀浆器内 于冰浴中匀浆5 min,匀浆液于4℃ ,3 000 r/min 离心1 0 rain,共2次,取上清于4℃ ,12 000 r/min 离心1 5 min,收集的上清即为不含细胞核和线 粒体的胞浆成分。测定蛋白含量后进行Western 印迹分析。 1.7 统计学处理 实验均重复3次。所有 数据用元±s表示,采用SPSS1 0.0统计软件对 数据进行单因素方差分析(one—way ANOVA), P<0.05为差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 API促进BGC823细胞凋亡作用 PI染色 FCM分析结果显示,API(20,4O,80 g/mL)处理 BGC823细胞48 h后的凋亡率分别为1 3.1% , 20.6% ,34.0% ,较对照组2.9% 高。说明API具 有促进BGC823细胞凋亡作用,呈浓度依赖性(图 1,封二)。 2.2 API对BGC823细胞线粒体跨膜电位的 影响 用罗丹明123作为荧光探针测定线粒 体跨膜电位,其被线粒体摄取的量与△ m成正 比。API(2O,4O,80 g/mL)处理后,BGC823 细胞的罗丹明123的荧光强度分别为105.0± 3.3,98.4±3.3,65.7±5.0,较对照组 (138.0±3.5)明显降低(图2,封二),且随着 API浓度增加荧光强度降低。表明API降低 BGC823细胞线粒体跨膜电位,与剂量呈正相关。而API 40 g/mL+Ac-LEHD.CHO组罗丹 明1 23的荧光强度(1 1 5.2±1 1.0)仅稍低于对 照组,说明Ac.LEHD.CHO 能抑制API降低 BGC823细胞线粒体跨膜电位的作用。 2.3 API对BGC823 细胞caspase-9 活性的 影响 Caspase.9是线粒体诱导凋亡途径中的 关键caspase,API(2O,4O,80 g/mL)作用于 BGC823细胞48 h后,分光光度法检测caspase-9 活性,结果发现caspase-9活性分别为对照组的 5.0,7.0和8.5倍,而API 40 g/mL合用 caspase.9抑制剂组的caspase.9活性仅比对照组 增加1.4倍(图3)。可见API以剂量依赖方式 增加caspase.9活性,caspase-9抑制剂能显著抑 制API增强caspase.9活性作用。说明API诱导 BGC823细胞凋亡与活化线粒体途径相关。 2.4 API对凋亡线粒体途径相关蛋白表达的影 响 为进一步证实API通过活化线粒体途径 诱导BGC823凋亡,本研究进一步检测凋亡线 粒体途径相关蛋白的表达(图4)。结果提示, 随着API浓度增大,bax蛋白表达增加,bcl-2蛋 白表达降低,bax/bc1.2比值逐渐增大,Cyt C释 放随API浓度升高而增加,caspase.9和caspase- 3蛋白表达也随API浓度升高而增加。Caspase一 9抑制剂Ac.LEHD.CHO 能阻断API的上述 作用。 图3 芹菜素(API)对BGC823细胞caspase-9活性的影响。 不同浓度的API(20,40,80 g/mL)处理BGC823细胞 48 h后检测caspase-9活性(x±s,,z=3) 与对照组比 较,}}P<0.01 Fig.3 Effect of API on activity of caspase-9 in BGC823 cells. BGC823 cells were treated with diferent concentrations (20,40,80 g/mL)of API for 48 h,and then activity of caspase一9 was determined(x±5,,z=3) Compared with contro1. } } P <0.01 图4 芹菜素(API)对BGC823细胞线粒体信号途径相关蛋白的影响。不同浓度的API(20,40,80 g/mL)处理BGC823细胞 48 h,Western印迹分别检测bax,bcl一2,细胞色素C,caspase一3和‘’aspase-9的表达 Fig.4 Effect of API on the expression of mitochondrial signal pathway related proteins in apoptosis in BGC823.BGC823 cells were treated with diferent concentrations(20,40,80 p~g,/mL)of API for 48 h,and then protein expressions of bax,bcl-2,cyto· chrome c。caspase一3 and caspase-9 were determined by Western blot 3 讨 论 API可以使人前列腺癌细胞及人白血病细 胞HL一60发生选择性周期阻滞,并诱导细胞凋 亡。其诱导凋亡的机制可能是通过细胞色素C 的释放及半胱氨酸酶(casepase一9,casepase一3)的 激活而实现 。此外,API也可以通过激活 P53/wafl途径发挥抗肿瘤作用。API能使肿瘤 细胞内P53蛋白、P2 1/WAF1蛋白水平升高, 二者可以使细胞周期发生阻滞,并通过P53途 径诱导肿瘤细胞凋亡 。核因子一KB(NF—KB)、 B细胞淋巴瘤/ 白血病2(bcl一2),bax(bcl一2的 家族成员)也参与了API的诱导肿瘤细胞凋亡 作用 。NF—KB的活化能阻止处于半胱氨酸 酶联反应上游的casepase一8活化,并引起凋亡抑 制剂蛋白的表达。API能够抑制NF—KB蛋白的 表达,使bax,bcl一2的比值发生转变,最终诱导细胞凋亡的发生。本文采用PI染色FCM分析 发现:随着API浓度升高,BGC823细胞凋亡率 增加。说明API具有促进BGC823细胞凋亡 作用。 线粒体跨膜电位在维持线粒体膜的完整性 和功能方面起着重要作用 J。本研究用一种能 被线粒体选择性吸收的荧光染料罗丹明123作 为指示剂,它的吸收率与△ll,m 成正比,FCM分 析测定结果显示,API能降低BGC823细胞中罗 丹明l23的荧光强度,呈剂量依赖性。表明API 能以剂量依赖方式降低BGC823细胞中zX,m。 线粒体依赖性细胞凋亡通路中,线粒体跨膜电 位降低导致Cyt c释放增加。本研究用Western 印迹检测BGC823细胞胞浆中细胞色素c蛋白 的表达,结果证实随着API浓度增大,细胞色素 c表达增加。以上结果表明,API能降低 BGC823细胞线粒体跨膜电位,促进细胞色素c释放。 细胞色素c从线粒体释放后与ATP、凋亡蛋 白酶激活因子(apoptotic protease activating factor· 1,Apaf.1)联合作用,依次激活caspase·9, caspase.3和PARP等,导致细胞凋亡。本实验用 caspase.9分光光度法检测试剂盒检测caspase·9 的活性,发现API能增加BGC823细胞中 caspase.9的活性。用Western印迹检测发现API 能上调caspase.9和caspase.3蛋白的表达。Bcl· 2家族成员在细胞凋亡的线粒体途径中起重要 调控作用 。在细胞凋亡过程中,bc1.2家族 促凋亡成员如bax过表达,形成同源二聚体后被 激活,发生构象改变,可引起线粒体大量释放 Cyt c;而抗凋亡成员如bc1.2和bc1.XL过表达, 与bax形成异源二聚体,可对Apaf.1结构进行 调控,抑制Cyt c释放,最终发挥抑制细胞凋亡 作用¨ “』。本文用Western印迹检测BGC823细 胞中bax和bc1.2蛋白的表达情况,发现API以 剂量依赖方式上调bax的表达,下调bc1.2的表 达,使bax/bc1.2的比值增大。而caspase.9抑制 剂Ac.LEHD.CHO能阻断API的上述作用。说 明API通过调节bax/bc1.2比值激活BGC823细 胞中caspase.9,caspase.3级联反应。 综上所述,API能上调bc1.2家族促凋亡成 员bax蛋白表达,下调bc1.2蛋白表达,使bax/ bc1.2比值升高,降低线粒体跨膜电位,促进Cyt c释放,从而激活caspase.9,caspase.3级联反应, 通过调控线粒体凋亡诱导途径诱导人胃癌 BGC823细胞凋亡。 |