木犀草素生物活性研究 |
发布时间:2013-12-10 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1476 |
摘 要:该文报道对木犀草素抗氧化活性及抗菌活性研究。结果表明:木犀草素添加量以0.02%为宜。其效果与同剂量BHT相当,比同剂量茶多酚抗氧化效果好。还原能力和消除羟自由基能力均比茶多酚和BHT强;且对食品中常见供试四种菌具有高效抗菌活性。并随浓度增加而增强。对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、啤酒酵母和大肠杆菌完全抑制浓度分别为300mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L。具有高效抗菌活性;表明木犀草素作为食品天然防腐剂和天然抗氧化剂具有开发潜力。 关键词:木犀草素 抗菌活性 抗氧化活性 天然防腐剂 Research on Biological Activity of Nature Luteolin Abstract:This paper studied the antioxidative effect and the antimicrobial activity. It was found that the optimum quantity luteolin added to the reaction mixture was 0.02%, which was equivalent to BHT and stronger than that of GTP at the same dosage. The reducing power and ·OH scavenging ability in luteolin are better than in BHT and GTP. It against four kind of common food contaminative microorganism is determined. Result showed the minimal inhibition concentration (MIC) were 300 mg/L against Staphylococcus aureus, 200 mg/L against Bacillus subtilis, 250 mg/L against beer yeast, 300 mg/L against Escherichia coll. It have high antimicrobial activity. All of these results confirm that luteolin is of potential value and cxploition in food industry Key words:luteolin; antimicrobial activity; antioxidative activity; natural food antiseptic 食品遭受微生物污染会腐败变质,因而要加入防 腐剂抗菌、并添加抗氧化剂以延长食品保质期。常用 的一些化学防腐剂如苯甲酸钠已引起消费者对其安 全性质疑,故科研工作者把注意力转向天然防腐剂研 究开发利用上,从植物中寻找有抗菌、抗氧化作用且 安全性高的活性物质。 木犀草素是一种有代表性天然黄酮⋯,其具有抗 氧化性,可用以抑制油脂食品劣变 。有关药理及临床 试验结果表明,木犀草素有抗菌、抗病毒及降血压、降 血脂作用¨ 。经对数百例支气管炎患者临床研究表明, 其有效率超过90%,完全缓解者达63.8%,能对咳嗽有效 缓解:且经检测并未对肝脏、心脏或肾脏有所损害¨ 花生,我国常年栽培面积达3,000万亩,年产荚果 600万吨。按含壳33%计算,可得壳约200万吨 。果 壳现大部分用作燃料,直接影响花生综合利用价值。 花生壳除含有较多碳水化合物及粗纤维外,还含有少 量黄酮类化合物,主要为木犀草素(毛地黄黄酮,Luteolin), 花生壳甲醇提取物中木犀草素含量为12.6% 。 本实验对花生壳乙醇提取物中分离纯化木犀草素进 行其抗菌和抗氧化活性研究。 1材料与方法 1.1材料和仪器 山东临沂产新鲜成熟花生壳:试验菌种为金黄色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和啤酒酵母( . cherichiacolO;猪油为颓鲜猪板油熬制;现榨芝麻油,茶 多酚和BHT均为食用级(广州食品添加剂公司);理化试 剂(分析纯)。 RE一52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂): UV-265型紫外可见分光光度计(日本岛津公司):超净工 作台;电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)。 1.2 实验方法 l-2.1木犀草素制备 将新鲜成熟花生壳清洗。晾干,粉碎过400目筛, 准确称取1000g,用95%乙醇。70~C提取三次,每次水浴 加热回流3小时;过滤残渣,合并滤液,真空浓缩干燥。 石油醚脱脂。再用碱溶解酸析出去杂,经硅胶柱层析分 离纯化。用95%乙醇重结晶获得纯度为98%木犀草素。 1.2.2抗氧化能力测定 1.2.2.1硫代巴比妥酸(TBA)快速测定法 将木犀草素和BHT分别以设计添加量(均为质量 比)加入芝麻油中置于60"C烘箱中恒温,24小时后进 行测定。具体为:取需要测定油样l m1分别加入2 ml 20%-氯乙酸,与2ml 0.28%硫代巴比妥酸溶液,混匀后 沸水浴15min,冷却加5ml氯仿,取上清液于532nnl下 比色。试验重复两到三次,用A532平均值比较其抗氧化 性强弱。 1.2.2.2清除·OH能力测定方法 用FeSO4和H202产生·OH,以·OH氧化水杨酸 钠所得产物吸光值表示·OH多少,吸光值越小,则·OH 越少,清除效果越好。 不同抗氧化剂溶解后置于离心管中,定容至1 ml, 加入12mmol/L水杨酸钠0.5ml,0.9mol/LFeSO40-5ml, 最后加18 mmol/L H202 l ml启动反应,37℃恒温水浴 反应l h后,5000 r/min离心10 min,取上清液并稀释 至l0 ml,在510 nlT1分光光度计上测吸光值A,根据以 下公式计算·OH清除率。 清除率(%)=[{A一(A1一A2)}/a]×100% A:不加抗氧化剂时体系吸光值; A1:加入提取液后体系吸光值; A2:提取液本底吸光值。 1.2.2-3还原能力测定方法 取不同抗氧化剂溶解并稀释至2.5 ml,加入0.2 mol/L 且pH6.6磷酸钠缓冲溶液2.5 ml及l%赤血盐2.5 ml, 于50℃水浴反应20 min后急速冷却。加入10%三氯 乙酸溶液2.5 ml,于3000 r/min离心10 min,取上清液 5ml,加入蒸馏水4ml及0.1%三氯化铁溶液l ml,混 合均匀,10 min后于700 am测定其吸光值,吸光值越 大,表示还原能力越强。 1.2-3抗菌能力测定 抗菌能力测定采用试管稀释法 取两环斜面菌种于5 ml液体培养基(肉汤膏10 g、 蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、NaC1 5g和水1000ml组成, pH调到7.2)在37~C(酵母27"C)培养6 h,显微镜下观 察计数,调整到含菌10 ~10 /mL备用。 用液体培养基将木犀草素释成不同浓度,灭菌 锅中灭菌,待冷至室温后,超净工作台中,在无菌条 件下接种50 l制备好菌种,同时设吐温一80接菌和 对应浓度药物不接菌,重复三次。培养箱中37"C(酵 母27℃)培养24 h后,在640 nlTl测定吸光度,以吸 光度为纵坐标,药物浓度为横坐标绘制抑菌曲线。曲 线中吸光度开始下降浓度为起始抑菌浓度,吸光度 降到和对应药物不接菌吸光度相等时浓度为完全抑 制浓度(MIC)。从完全抑制后各管中取50 l接种于平板培养基中再培养48 h,以不长菌为杀菌浓度 (MBC)。 2结果与分析 2.1抗氧化剂添加量与抗氧化效果 表1 TBA比色法测定A5∞平均值 由表1列示木犀草素和BHT以三个添加水平加入 猪油中采用快速测定法试验结果,由表1可见,木犀草紊 具有良好抗脂质氧化能力,其最适添加量为0.02%左右。 2.2木犀草素还原能力和清除·OH能力 木犀草素清除·OH能力测定结果如图l所示。 图1 清除·0H能力比较 木犀草素还原能力测定结果如图2。 图2 还原能力比较 木犀草素具有供氢能力,H 与自由基结合,使之 还原为惰性化合物或稳定自由基,从而可清除机体内 过多有害自由基。羟自由基是毒性最大活性氧,对细 胞内DNA破坏作用最大 ,活性氧所导致DNA损 伤在细胞里积累被认为是机体老化主要原因 。黄酮 B环邻二酚羟基(3’,4’一邻二羟基)存在极大增强其 抗氧化活性,可认为这是黄酮类高效抗氧化剂结构基 础¨ 。而木犀草素结构为3’,4’,5,7-四羟基黄酮,因 此其B环邻二酚羟基是清除羟自由基的关键功能 团。从图1、图2可看出,随着添加量增加,清除率和 还原能力都在增强。当木犀草素加入量为0.05%时, 对羟自由基清除率达96.02% ,明显高于BHT,比茶 多酚略好。 2.3木犀草素抑菌曲线测定结果 图3 木犀草素对枯草杆菌抑菌曲线 不同浓度木犀草素对枯草杆菌等菌抑制结果见 图3~ 图6。从图中可看出:当木犀草素浓度增大到 50 mg/L时,吸光度开始降低,说明随浓度增加,菌的 生长受到抑制数量在减少,此浓度为起始抑菌浓度: 当浓度高到200 mg/L,吸光度值降到与药物不接菌线 重合,说明此时菌生长受到完全抑制,此浓度为完全 抑菌浓度。从图3~ 图6可看出,对枯草杆菌起始抑制 浓度为50 mg/L,完全抑制浓度为200 mg/L;对金黄 色葡萄球菌起始抑制浓度为25 mg/L,完全抑制浓度 为300 mg/L;对大肠杆菌起始抑制浓度为50 mg/L, 完全抑制浓度为300 mg/L;对啤酒酵母起始抑制浓度 为25 mg/L,完全抑制浓度为250 mg/L。实验测得供 试验菌种MBC见表2。 表2 木犀草素杀菌MBC值(m#L) 3结论 TBA快速测定法结果表明,木犀草素在芝麻油中 显示良好抗氧化性,有效浓度为0.02%。在此浓度下, 木犀草素在芝麻油和猪油中抗氧化效果与BHT相近, 在猪油中抗氧化能力比茶多酚强。且木犀草索还原能力 和清除羟自由基能力均比茶多酚和BHT强。木犀草素 对食品中常见供试四种菌具有高效抗菌活性,且随浓度 增加而增强,对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、啤酒酵母和 大肠杆菌完全抑制浓度分别为300 mg/L、200 mg/L、 250 mg/L、300 mg/L;表明木犀草素作为天然防腐剂和 抗氧化剂具有很好开发潜力,在食品、医药等领域有着 广泛应用前景。 |