木犀草素的体外抗炎机制研究 |
发布时间:2013-12-10 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1443 |
摘 要:【目的】观察木犀草素对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞(小鼠单核/巨噬细胞系)核因子κB(NF-κB)和环氧合酶2(COX-2)表达及NF-κB DNA结合活性的影响,探讨其体外抗炎机制。【方法】以RAW264.7细胞为研究对象,选用对数生长期的细胞,分别设空白对照组,脂多糖(LPS)处理组(模型组),5、15、45μmol/L木犀草素处理组(中药低、中、高剂量组);加入药物30min后再加入终浓度为1μg/mL的LPS继续培养12h,分别采用酶免疫测定法(EIA)检测木犀草素对RAW264.7细胞前列腺素E2(PGE2)生成的影响;电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测NF-κB的DNA结合活性;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定RAW264.7细胞中COX-2 mRNA的水平;Western blot法测定RAW264.7细胞中NF-κB和COX-2蛋白的表达。【结果】木犀草素能显著性抑制LPS诱导的RAW264.7细胞PGE2的生成,降低NF-κB的DNA结合活性;下调LPS诱导的RAW264.7细胞COX-2 mRNA、mRNA和COX-2蛋白的表达。【结论】木犀草素的抗炎作用可能与其能抑制核内NF-κB的表达和DNA结合活性从而下调COX-2的表达有关. 关键词:木犀草素/药理学 炎症/中药疗法 信号传导 基因表达调控 细胞培养 Studies on In-vitro Anti-inflammatory Mechanism of Luteolin Abstract:[ Objective] To investigate the in-vitro anti-inflammatory mechanism of luteolin by observing the effect of luteolin on nuclear factor-kappa B (NF-κB) and COX-2 expression as well as DNA-binding activity of NF-κB in RAW264.7 ceils activated by lipopolysaccharides (LPS). [ Methods ] RAW264.7 cells at logarithmic growth phase were allocated to blank control group, model group (treated with LPS) and luteolin groups (treated with 5, 15, and 45 μmol/ L luteolin respectively). After being treated with luteolin for 30 rain and then incubated with 1μg/mL LPS for 12 hours, the change of prostaglandin E2 (PGE2) level was observed by enzyme immunoassay (EIA), DNA-binding activity of NF- κB was detected by electrophoretic mobility shift assay (EMSA), mRNA expression of COX-2 was examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and NF-κB and COX-2 protein expression in RAW264.7 cells was analysed by Western blotting. [ Results] Luteolin obviously inhibited the formation of PGE2, decreased DNA-binding activity of NF-κB and down-regulated mRNA expression of COX-2 as well as NF-κB and COX-2 protein expression in RAW264.7 ceils activated by LPS. [Conclusion] The anti-inflammatory mechanism of luteolin may be related with the down-regulation of COX-2 expression by inhibiting the expression of NF-tcB and DNA-binding activity. Key words:LUTEOLIN/pharmacology; INFLAMMATION/TCD therapy; SIGNAL TRANSDUCTION; GENE EXPRESSION REGULATION; CELL CULTURE 木犀草素(Luteolin)属于黄酮类化合物,主要 存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物中,研究 表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调 节等多种作用[卜 ,木犀草素的抗炎作用与其抑制 炎症介质的释放和核因子 B(NF-xB)介导的基因 表达有关[3-4]。本文观察了木犀草素对脂多糖 (LPS)诱导的RAW264.7细胞NF_fcB表达、DNA结 合活性以及对环氧合酶一2(COX-2)表达的影响,以 进一步探讨木犀草素抗炎的作用机理。 1 材料与方法 1.1 药品及试剂 木犀草素(纯度>98%)和前 列腺素E2酶免疫分析试剂盒(PGE2 EIA Kit)均为 美国Cayman公司产品;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰 胺、二甲基亚砜(DMSO)、焦碳酸乙二酯(DEPc) 等为Sigma公司产品;RPMI一1640为Gibco公司产 品;超级小牛血清为杭州四季青生物工程公司产 品;总RNA提取试剂(Trizo1)为Invitrogen公司产 品;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)一步法试剂 盒为宝生物(大连)工程有限公司产品;100 bp DNAmarker、N,N,N。N.四甲基乙二胺(,IEMED)、6 倍上样缓冲液均为华美生物工程公司产品;增强化 学发光(ECL)试剂、抑酞酶(Aprotinin)均购于 上海华舜生物工程有限公司;p—aetin山羊IgG多克 隆抗体、NF.fcB小鼠IgG单克隆抗体和COX一2山羊 IgG多克隆抗体均为北京中山公司产品;聚偏 (二)氟乙烯(PVDF)膜为美国Pall Gelman公司产 品;NF-xB寡核苷酸链为上海生物工程公司产品; 7_32p标记三磷酸腺苷([7_32p]ATP)为北京亚辉 生物工程公司产品;T4噬菌体多核苷酸激酶为 Promega公司产品。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 RAW264.7细胞(小鼠单核/巨 噬细胞系)购自上海细胞研究所,在37℃、体积 分数为5%CO2条件下,用含体积分数为10%小牛 血清、青霉素(1×lOs U/L)及链霉素(100mg/L) 的RPMI一1640培养液传代培养。 1.2.2 PGE2含量测定 将对数生长期的 RAW264.7细胞接种于6孔培养板中,设空白对照 组,脂多糖(u s)处理组(模型组),5、15、45 pmol/L木犀草素处理组(中药低、中、高剂量 组);药物加入30 min后再加入终浓度为1,g/mL 的LPS,继续培养12 h;收集细胞培养液,以PGE2 EIA Kit测定其中的PGE2浓度,每组重复3次。 1.2.3 电泳迁移率变动分析(EMSA) 细胞培养 及分组同1.2.2。细胞核蛋白的提取:细胞以冷磷 酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后加入100 缓冲液 A [10 mmol/L N 2.羟基哌嗪.N.2.乙磺酸(HEPES) 一KOH、1.5 mmol/L M[gC12、10 mmol/L KC1、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、10 mg/L Leupeptin、 3.5 mg/L抑酞酶(Aprotinin)、1 mmol/L二硫苏糖醇 (DTF)],冰上放置15 min,再加体积分数为10%壬 基酚聚氧乙烯醚(NP.40)10 ,振荡混匀;然后 10000 g、4 oC、离心10rain;于沉淀中加100 缓 冲液B l 20 mmol/L HEPES.KOH、2.7 mol/L甘油 (Glycero1)、420 mmol/L NaC1、1.5 mmol/L M l2、1 mmol/L PMSF、1 mg/L Leupeptin、10 mg/L Aprotinin、 1 mmol/L DTr],冰浴30 min,离心取上清液,考马 斯亮蓝法测定核蛋白浓度后, 一70℃保存。 双链寡核苷酸探针的标记:含有NF.KB特异性 识别位点的双链脱氧寡核苷酸序列如下:5’. AGT AGGGGAC CCAGGC-3’;3’-TCAACTCCCC TGAAAG( T℃cG5’。依次加入寡核苷酸探针(1O pmol/ )1.0 、10倍T4多核苷酸激酶缓冲液2 、T4多核苷酸激酶(1O u/ )1.0 、[.,/_32p] 一ATP(10 uCi/t,-L)2.5 、无核酸酶水13.5 , 共2O 。反应混合液于37℃孵育10 min,加入0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)1 终止反应。乙 醇沉淀法去除未结合标记物。 取1O 核蛋白与放射性核素标记的DNA探针 在室温进行结合反应30 min,总体积为1O 。DNA一 蛋白复合物经40 g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电压110V,电泳60min。真空负压加热干燥凝胶后, 一70℃放射自显影,显影后扫描至计算机。用 Bandsean 4.3图像分析软件进行光密度积分值分析。 每个图像均重复分析3次,取平均值。 1.2.4 RT-PCR测RAW264.7细胞中COX一2 mRNA 的表达RAW264.7细胞分组及处理同1.2.2。收 集细胞,用Tfizol试剂提取细胞的总RNA,按一步 法试剂盒步骤进行RT.PCR。COX.2引物为:上游 5’一GGGAAGCCrIT] CAACC一3’,下游5’一GAACCCA GGTCCTCGCTr-3’,产物长度为245 bp;B—actin引物 为:上游5’一CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC一3’, 下游5’一AGGGTACA CCGCCAGAC一3’, 产 物长度为587 bp。COX一2的反应条件为:5O℃逆转 录30 rain;94 oC预变性2 min;94 oC变性45 S,56℃复性1 min,72 oC延伸1 min,扩增3O个循环; 72~(2延伸10 min。PCR产物以15 L琼脂糖凝胶电 泳,Doc Gel 1000成像系统观察结果并拍照。同时 进行光密度积分值分析,以COX.2 PCR产物与内 参照B.actin PCR产物的光密度积分值之比作为 COX.2 mRNA的相对含量值。 1.2.5 Western blot测RAW264.7细胞中COX.2和 NF.tcB蛋白的表达 细胞处理同1.2.2,细胞裂解 液裂解细胞后提取总蛋白,考马斯亮蓝法测定样品 总蛋白含量。每组各取5O 蛋白质样品加上样缓 冲液煮沸变性后,进行100 g/L十二烷基硫酸钠一 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS.PAGE);电转移至 PVDF膜;用含5O L脱脂奶粉的 s缓冲盐溶液 (TBS,pH 8.0)封闭2 h;分别加入适量COX.2、 NF.KB和~-actin多克隆抗体,摇床上室温反应2 h; 洗膜3次,加辣根过氧化物酶标记的二抗,室温反 应2 h;洗膜后作ECL化学发光,x片曝光显影。 图像经扫描仪扫描后,用图像分析软件BandScan 4.3进行光密度积分值分析,以目的蛋白与内参照 ~-actin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋 白表达量的相对含量值。 1.3 统计学处理采用SPSS 11.0统计软件进行。 2 结果 2.1 木犀草素对RAW264.7细胞中LPS诱导PGE2 生成的影响 表1结果显示,空白对照组脚264.7 细胞中PGE2生成很低,当加入诱导剂LPS后,PGE2 的生成显著性增加,而15、45 tmaol/L木犀草素组中 的PGE2生成显著性下降,表明中、高剂量的木犀草 素可显著性抑制PGE2的生成。 表1 木犀草素对RAW264.7细胞中LPS诱导 PGE2生成的影响 Table 1 Efects of luteolin on LPS-induced PGE2 synthesis in RAW2_54.7 cells(膏±S) 统计方法:单因素方差;① :P<0.01,与空白对照组比较( the blank control group);② :P<0.01,与模型组比较(协themodel group 2.2 木犀草素对RAW264.7细胞中NF.xB的DNA 结合活性的影响 由图1可见,空白对照组 RAW264.7细胞核蛋白中仅有少量NF.xB与特异性 寡核苷酸探针结合;而模型组细胞内NF.xB活性明 显高于空白对照组,低、高剂量的木犀草素明显抑 制了NF.xB的DNA结合活性。 2.3 木犀草素对RAW264.7细胞COX.2 mRNA表达 的影响 图2结果表明,空白对照组中RAW264.7 细胞COX.2 mRNA的基础表达很低,而LPS可以明 显上调RAW264.7细胞COX.2 mRNA的表达量,加 入浓度为15、45 tlmol/L的木犀草素后,COX.2 mRNA的表达均明显下降,表明中、高剂量的木犀 草素可显著性抑制COX.2 mRNA表达。 2.4 木犀草素对LPS诱导的RAW264.7细胞中NF- 和COX.2蛋白表达的影响 Western blot结果显 示,终浓度为1 meVL LPS处理细胞后,NF-xB和 COX.2蛋白条带明显变粗,木犀草素处理组NF.xB 和COX.2的蛋白表达量经图像分析结果显示:15、 45 tlmol/L木犀草素处理组分别与模型组比较,NF. B和COX.2蛋白表达均明显降低,表明中、高剂 量的木犀草素可显著性抑制NF.xB和COX.2蛋白表 达(图3)。 3 讨论 NF-xB是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子,涉及免疫和炎症反应的快速早期基因激活 和信号转导,具有和某些基因启动子区的特定核苷 酸序列结合而启动基因转录的功能l_5 J。典型的NF. fcB是由p50和p65组成的异二聚体,它与抑制性蛋 白IxB结合而为非活性状态,IxB通过锚蛋白重复 序列和NF-xB的Rel同源结构域相互作用,遮盖了 NF.s:B上的核定位序列,从而使NF-xB滞留于胞 质。NF.xB可以被许多刺激剂如细胞因子、氧化 剂、病毒氧化剂、病毒激活,被激活的NF.xB与 IxB解离,转入核内与靶基因的特异位点结合,调 控基因转录l_6一 7l。 图1 木犀草素对Ra,W2fi4.7细胞中NF.KB的 DNA结合活性的影响 [q~ ro 1 Effec【s of Iuteolin on廿_Ie NF-v.B bind activity in ind Iced R V 、弭.7 cells detected bv日 sA 研究表明L8j,COX.2启动子上含有NF.fcB位点 序列,NF.fcB是启动COX.2转录激活的重要转录因 子。LPS可激活巨噬细胞,诱导COX.2的高表达, LPS首先与细胞表面的脂多糖结合蛋白 (1ipopolysaccharide binding protein,LBP)结合,LBP 将LPS运送到巨噬细胞膜上与CD14结合,从而激 活胞内PKA和(或)PKC和(或)MAPK信号传导通路,最终引起IxB的磷酸化和降解,使NF-xB从 NF.xB.KBs复合物解离并活化,激活的NF.xB转位 到细胞核内与COX.2基因上NF.tcB位点序列结合, 启动COX.2的转录过程,导致COX.2高表达 9, 从而产生大量的PGE2。PGE2是一种重要的炎症介 质,介导炎症反应中疼痛和发热的产生。 本研究结果表明:浓度为15、45/.tmol/L的木犀草素能显著性抑制LPS诱导的PGE2生成,并下 调LPS诱导的COX.2mRNA和蛋白表达,提示木犀 草素通过降低COX.2 mRNA表达,使COX.2蛋白生 成减少,从而抑制COX.2介导的PGE2生成。结果 还发现木犀草素可显著性抑制NF.xB的蛋白表达及 其DNA结合活性,表明木犀草素除了通过下调NFfcB 表达,还可能通过影响其他与NF-xB DNA结合 活性密切相关的因素,最终抑制NF-xB的DNA结 合活性。研究结果提示木犀草素的抗炎作用与其抑 制COX.2表达和P 的生成有关。而木犀草素对 COX.2表达的抑制作用则可能与其抑制NF-xB的表 达,降低NF.xB DNA结合活性密切相关,这可能是 木犀草素抗炎的主要作用机制之一。 |