东北铁线莲(Clematis mandshurica Rupr．)为毛茛科铁线莲属植物．主要分布于东北及内蒙北部地区，一般根部人药，嫩叶、地上茎可食用，东北铁线莲中含有丰富的生物活性物质．主要用于治疗风湿痹痛、关节不利等症状．现代药理研究表明具有多种药理作用，如解痉、镇痛抗炎、抗肿瘤、利胆和降血压等功效：

总黄酮作为一类重要的天然有机化合物．因其具有众多药理作用如抗癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、抑菌抗病毒、抗氧化抗衰老而越来越受到人们的关注．木犀草素是一种重要黄酮化合物。在自然界分布广泛．具有良好抗氧化性和抗菌性．具有降低血脂和胆固醇．降压及免疫双向调节药理作用．可作为食品天然抗氧化剂和防腐剂开发．具有广阔开发与应用前景

目前关于东北铁线莲中总黄酮和木犀草素的含量测定尚未见报道．该文建立了东北铁线莲中总黄酮和木犀草素的含量测定方法．为东北铁线莲的综合利用提供科学的理论依据.

1 材料与方法

1。1 材料与试剂

东北铁线莲购自安徽省毫州市华申药业有限公司：木犀草素和芦丁对照品均购自中国药品生物制品检定所(木犀草素批号1 1 1520—200504．供含量测定用：芦丁批号100080—200707．供含量测定用)：甲醇(色谱纯，天津大茂化学试剂公司)；水为二次蒸馏水：其余所用试剂均为分析纯。

1．2 仪器

LC一10AD型高效液相色谱仪配备(日本岛津公司)．SPD一10Avp紫外一可见检测器：752N紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；超声波药品处理机f济宁金百特电子有限责任公司佃T／C— YCL)：BP211D 型电子天平(Sagorius公司)；RT一08 手提式高速中药粉碎机(大德乐机械有限公司)。

2 方法与结果

2．1 木犀草素含量测定 2．1．1 色谱条件 参照文献l8_-1 3分别对甲醇～水、甲醇一0．2％(V／V)磷酸溶液和甲醇一0．4％(V／V)磷酸溶液三种流动相进行了选择．结果表明甲醇一0．4％ (v／v)磷酸溶液为流动相时，分离度为3．158．理论塔板数为16 393．保留时间约为30 min左右．以梯度洗脱方式对木犀草素进行洗脱． 洗脱程序为0 min到15 min，40％A 到60％A：15 min到20 min． 60％A到70％ A；20 min到30 min，70％A到80％A； 30 min到35 min，80％A 到95％A：35 min到45 min．95％A；45 min到55 min，95％A 到30％A；55 min到60 min，30％A～停泵，其中A为甲醇，B为 0．4％(V／V)磷酸溶液。根据以上试验结果确定色谱条件：色谱柱EI2]为Diamonsil C18(250 ram~4．6 rain， 5 m)；流动相为甲醇一0．4％磷酸溶液(V／V=30：70)；流速：1．0 mL／min，梯度洗脱；柱温：40℃，进样量20 L，检测波长为350 nrn。分别取对照品溶液，供试品溶液各20 L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定．记录色谱图。

本实验采用紫外分光光度计对木犀草素对照品溶液进行全波长扫描，以甲醇作为空白试剂．结果木犀草素的最大吸收波长为350 nm与早期文献报道一致，最终确定木犀草素的检测波长为350nm。

2．1．2 对照品溶液的制备取木犀草素对照品适量。精密称定，加甲醇配制为80 R,g／mL对照溶液。 2．1．3 供试品溶液的制备称取2．0 g东北铁线莲药粉。加入20mL甲醇。摇匀。超声提取45 rain，静置，冷却至室温，过滤，用5 mL甲醇清洗滤渣一次，过滤。合并滤液。转移至25 mL容量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0．45 m微孑L滤膜过滤，作为供试品溶液。

2．1．4 方法线性范围考察精密吸取木犀草素对照品适量，分别配制成浓度为O．5，1．O，2．0，4．0，8．0、 10．0和20．0 I~g／mL的梯度溶液．分别吸取各梯度溶液20 L，注入液相色谱仪，记录峰面积，以木犀草素对照品进样浓度C(p~g／mL)为横坐标，峰面积积分值 为纵坐标．绘制标准曲线。得回归方程A= 666．870C+45．787．r=0．999 4，结果表明木犀草素进样浓度在O．50～2O．00 I~g／mL范围内呈良好的线性关系。

2．1．5 精密度实验精密吸取线性关系项下浓度为10．0 I．Lg,／mL的对照品溶液，连续进样5次，测定 木犀草素吸收峰面积积分值，RSD值为1．70％，表明本实验精密度良好。

2．1．6 稳定性实验取同一供试样品溶液．分别于配制后0，2，4，6，8 h进行测定，记录木犀草素峰的峰面积。结果RSD值为1．06％。结果表明样品溶液在8 h内稳定。

2．1．7 重复性实验取同一批东北铁线莲药粉．按“2．1．3”项下的的制备方法制备5份供试品溶液，同条件测定．记录木犀草素峰的峰面积，其RSD值为 1．21％。说明此方法重复性较好。实验结果见表3。 2．1．8 加样回收率实验 称取已知含量(30．013 g)的东北铁线莲药粉2．00 g，共5份，分别精密加入木犀草素对照品溶液0．75 mL．按“2．1．3”项下的的制备方法制备5份供试品溶液．按2．1．1色谱条件测定 结果表明平均回收率为99．2l％，RSD值为2．72％。

2．1．9 样品测定 取5份东北铁线莲药粉．按 “2．1_3”项下的的制备方法制备供试品溶液．按2．1．1 色谱条件测定．测得木犀草素的含量分别为29．125、 29．020、30．788、30．348、30．578 g／g， 平均含量为 29．972 tzg／g，由此可知东北铁线莲中木犀草素的含量较低。

2．2 总黄酮含量测定

2．2．1 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品 0．201 g，加60％(V／V)乙醇稀释到100mL，摇匀，即得浓度为2．01 mg／mL的对照品溶液。

2．2．2 供试品溶液的制备称取2．0 g东北铁线莲药粉，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入60％(V／ )乙醇20mL，摇匀，超声提取30min，静置，冷却至室温，过滤，滤渣重复上述超声提取过程1次，滤过，滤渣用5 mL 60％(v／v)乙醇清洗1次，过滤，合并2次所得滤液，加60％(v／v)乙醇定容至50 mL．摇匀．得供试品溶液。

2．2-3 检测波长的选择 吸取芦丁对照品溶液和供试品溶液各2 mL于25 mL容量瓶中．加6O％(v／)乙醇4 mL，摇匀，静置6 min，加5％(m／V)NaNO， 0．4 mL，摇匀，静置6 min，加10％(m／V)A1(NO ) 0．4 mL，摇匀，静置6 min，再加入4％(m／V)NaOH 4 mL，摇匀，用60％(V／V)乙醇定容到刻度．放置l5 min．同时作空白对照．在400～600 nm范围内进行波长扫描[13 3．结果对照品溶液和供试品溶液均在 510 nm有最大吸收．由此确定检测波长为510 nm 2．2．4 方法线性范围考察分别精密移取0．1、0．2、 0-3、0．4、0．5、0．6 mL芦丁对照品溶液于25 mL容量瓶中，加60％(V／V)乙醇4 mL．摇匀，静置6 min，加 5％(m／V)NaNO 0．4 mL，摇匀，静置6 min，加10％ (m／V)A1(NO3)3 0．4 mL，摇匀，静置6 min，加4％ (m／V)NaOH 4 mL，摇匀，用60％(V／V)乙醇定容到刻度．放置15 min．同时作空白对照，分别在510 nm 波长处测定吸光度．以对照品浓度C(mg／mL)为横坐标。吸光度A为纵坐标．绘制标准曲线。求得回归方程A=11．748C+0．003．r=0．999 9．结果表明芦丁进样浓度在0．008 04～0．048 24 mg／mL范围内呈良好的线性关系

2．2．5 精密度实验 吸取标准曲线项下浓度为 0．016 08 mg／mL的芦丁对照品溶液2 mL．按“2．2．4” 项下方法连续测定5次吸光度．记录数据．结果 RSD值为0．95％．精密度良好

2．2．6 稳定性实验称取2．0 g东北铁线莲药粉，精密称定．置50 mL容量瓶中，按“2．2．2”项下方法配制供试品溶液．按“2．2．4”项下方法．分别于配制后 0、30、60、90和120 min测定吸光度，RSD值计算结果为1．62％．表明供试品溶液在实验条件下120 min 内基本稳定．可满足测定要求

2．2．7 重复性实验取同一批东北铁线莲药粉．按 “2．2．2”项下的制备方法制备5份供试品溶液．依法测定吸光度．结果RSD值为1．39％ ，重复性较好。 2-2_8 加样回收率实验称取已知含量(4．425 mg／g) 的东北铁线莲药粉约2 g，共5份，精密称定，分别精密加人芦丁对照品溶液2．0 mL．按“2．2．2”项下的制备方法制备5份供试品溶液．按“2．2．4”项下方法测定吸光度．结果表明平均回收率为99．34％．RSD值为1．97％ 实验结果见表5

2．2．9 样品测定 取5份东北铁线莲药粉．按 “2．2．2”项下的的制备方法制备5份供试品溶液．按 “2．2．4”项下方法测定吸光度．结果测得总黄酮的含量分别为4．437、4．424、4．406、4．397、4．437 mg／g。

3 讨论

3．1 高效液相色谱法检测波长的选择

文献报道．采用高效液相色谱法测定木犀草素 含量时．一般分别在350 nm[9,1o1．254 nm E“]的检测波长条件下进行了研究．本实验采用紫外分光光度计对木犀草素对照品溶液进行全波长扫描．以甲醇作为空白试剂．结果木犀草素的最大吸收波长为350 nm．根据实验结果和参考文献确定350 nm为本实验的检测波长

3_2 高效液相色谱法分离柱的选择

根据参考文献rI2]．选择的色谱柱为DiaInonsi!C18 (250 mmX 4．6 mm，5 m，)。

3．3 高效液相色谱法供试品溶液制备方法的选择根据所查阅的文献 ．本实验以甲醇为溶剂．分别对热回流法、索氏提取以及超声提取3种提取方式进行选择 结果热回流法木犀草素峰面积、拖尾因子分别为720．906、2．07l，索氏提取法木犀草素峰面积、拖尾因子分别为637．400、2．179，超声提取法 木犀草素峰面积、拖尾因子分别为1 552．300、 1．572．根据木犀草素的峰面积、拖尾因子确定超声提取为较佳的提取方法．并在此基础上进行了超声次数、超声时间进行了探索。

3．3．1 超声次数的选择本实验考察了超声次数对提取效果的影响，精密称取2．0 g东北铁线莲粉末．提取2次，每次加入20 mL甲醇，每次超声提取 45 min，过滤，分别收集1、2次提取液，将各次提取液分别置于25 mL容量瓶中．加甲醇定容至刻度。摇匀。用微孔滤膜(0．45 m)过滤，取滤液作为供试品溶液．按正文色谱条件进行含量测定．第1次提取液测得的木犀草素峰面积1 698．056．第2次提取液在相应的保留时间处没有吸收峰．由此可见第2 次的提取量已经很小．故将提取次数确定为1次。 3-3．2 超声时间的选择 在超声次数对提取效果的影响实验的基础上．进一步考察了超声时间对提取效果的影响．精密称取2．0 g东北铁线莲粉末．加入20 mL甲醇提取1次，分别超声30、35、40、45、50 min．过滤，分别收集提取液，将各提取液分别置于 25 mL容量瓶中．加甲醇定容至刻度，摇匀．用微孔滤膜(0．45 m)过滤，取滤液作为供试品溶液，按上述色谱条件进行含量测定．木犀草素峰面积分别为 573．905、786，923、1 230．563、1 635．158、1 642．330，由结果可知木犀草素的峰面积随着提取时间的增加而增加．但是当时间增加到45 min时，峰面积变化很小。故将超声提取时间确定为45 min。

本实验建立的总黄酮和木犀草素含量测定方法操作简便。方法精密度高，重复性及线性关系良好。回收率较好，对于评价东北铁线莲的内在质量具有一定的参考意义.