生物技术在白藜芦醇研究中的应用 |
发布时间:2013-12-10 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:1363 |
摘 要:介绍了白藜芦醇的化学结构、发现、分布及合成途径等,总结了生物技术(包括酶工程、基因工程和细胞工程)在白藜芦醇研究中的应用,并展望了其应用前景及开发意义. 关键词:白藜芦醇 细胞工程 酶工程 基因工程 芪合酶基因 Application of biotechnology in research of resveratrol Abstract:It's introduced on chemical structure, discover, distribution and synthesis pathways of resveratrol. The applications of biotechnology are summarized including enzyme engineering,gene engineering and cell engineering in the researches. The future application and development are also viewed. Key words:resveratrol cell engineering enzyme engineering gene engineering stilbene synthase gene 1 白藜芦醇在植物体内的分布 白藜芦醇(Resveratrol,Res),化学名3,4,5一 三羟基一反一均二苯代乙烯(3,4’,5一trihydroxys— tilbene),分子式Cl4H 2O。,分子量228.2,是一种活 性非黄酮类多酚化合物,广泛存在于种子植物中,是一种植物抗毒素(Phytoalexin),是在植物受到真菌 侵染、紫外线照射或病理状况下而产生的,结构类似 于雌激素己烯雌酚 1940年首次从毛叶藜芦(VeYatYuD?grandiflo— rtua)根部得到了白藜芦醇.1960年Nonomura等提 出Res是某些草药治疗炎症、脂类代谢和心脏疾病 的有效成分.1977年在葡萄中发现Res作为植物抗 毒素存在.1989年WHO进行的一项流行病学的调 查结果显示“French Paradox”(法国悖论),即:高脂 肪膳食与冠状动脉硬化的低发病率呈明显一致性. 经过进一步研究,人们发现通过饮用葡萄酒摄取 Res是法国人心血管疾病发病率低的重要原因之 一 : 红葡萄酒因带皮发酵,果皮与果汁接触时间 长,使果皮中相当数量的Res能够进入葡萄酒中, 从而具有抗脂质过氧化作用,已知脂质过氧化作用 在动脉粥样硬化等心血管疾病的发生中起着重要的 作用.1992年在商业葡萄酒中首次发现了白藜芦 醇,同年学术界对葡萄酒富含白藜芦醇进一步进行 了确认.近些年来,国外很多学者对白藜芦醇的生物 学功能进行了深层次的研究,这些研究包括脂类代 谢、花生四烯酸代谢等 ,证实其具有许多重要的生 理活性,如:抗癌、保护心血管系统、雌激素样作用、 影响骨代谢等. 人们对白藜芦醇的自然资源进行了广泛的研 究,目前至少已经在葡萄科(爬山虎属,山葡萄树,蛇 葡萄属),百合科(藜芦属,菝属),蓼科(蓼属,大黄 属),豆科(槐属,落花生属,决明属,三叶草属,羊蹄 甲属,冬青属),桃金娘科(桉属),伞形科(棱子芹 属),莎草科(苔属),棕榈科(海藻属),买马滕科(买 马滕属)等21科31属72种植物中发现白藜芦 醇 ].其主要存在于蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)的根,蓼科植物虎杖(Polyg一 0 7lure cuspidatum Sieb.et Zucc)的根、茎,葡萄科植 物葡萄属(Vitis vinifera L.)的果皮、果核,百合科 植物藜芦(Veratrum nigrum L.)的根、茎、叶,豆科 植物落花生(Arachis hypogaea L.)的根、茎和花 中.尤其在新鲜的葡萄皮中含量较高,约50~i00 >g/g,并以反式为主.葡萄栽培品系、生长地点、 气候、种植技术、霉菌感染程度等都影响着白藜芦醇 的含量.酿制方法对葡萄酒中白藜芦醇含量的影响 尤为显著,红葡萄酒中白藜芦醇的平均含量达到4. 37 mg/L,而白葡萄酒中仅有0.68 mg/L[5].在提高 含量方面也进行过大量的研究,如:用收获前紫外线脉冲辐射的方法提高葡萄白藜芦醇的含量 ];用重 组体酵母株作为工具提高白葡萄酒中白藜芦醇的含量.研究表明,天然含RS(Resveratrol syn— thase)基因的植物在遭受刺激时,才能激发该基因 转录并转译成RS,进而瞬时合成白藜芦醇.在葡萄、 花生、松树等植物中具有诱导型芪合酶基因的表达 机制,但大多数植物细胞中虽然有STS酶的底物, 但缺少STS基因,从而缺乏在诱发因子作用下合成 该类植保素的能力. 由于白藜芦醇在植物中的含量很低,一般以苷 形式存在.国内外许多学者和生产商都采用化学方 法制取.一般来说,化学合成方法成本较低,但出于 食品安全性考虑,越来越多的学者主张从天然植物 中提取,尤其在国外白藜芦醇的生物提取更受重视, 且已经有了相当深度的研究. 2 生物技术在白藜芦醇研究中的应用 生物技术是20世纪后半期国际上突飞猛进的 技术领域之一,它为人类保健、农牧业、食品工业、环 境保护以及精细化工等产业的发展提供了前所未有 的动力.在提高次生代谢物的产量方面,生物技术发 挥了重要的作用.近几年来,人们也将其应用于白藜 芦醇的研究中,并取得了一定的研究结果. 2.1 酶工程在白藜芦醇研究中的应用 植物次生代谢途径中,酶控制着物质流向,其作 用是必不可少.因此不少科研人员也将酶工程 应用于白藜芦醇的研究中. 目前,在Res的生物合成途径中有5种酶已被 发现,分别为芪合酶(Stilbene synthase,STS),Res 合酶(Resveratrol synthase,RTS),过氧化物同功酶 (Peroxidase isoenzyme),赤松素合酶(Pinosylvin synthase,PS)以及苯基苯乙烯酮合酶(chalcone synthase,CHS).其中芪合酶(Stilbene synthase)是 白藜芦醇生物合成过程中起关键作用的酶[1 ,与查 尔酮合成酶(CHS,黄酮类化合物合成关键酶)同属 聚酮化合物合成酶家族,都是均二聚体.都可将3个 二碳单位缩合成线状四(甲)酮化合物,后者又分别 在这两种酶的作用下环化生成白藜芦醇和查尔 酮[1引.两种酶具有非常密切的关系,结构上具有高 度同源性,功能上也很相似 引.STS的底物专一性 不高,而且通过改变芪合酶的催化底物,可一定程度 地改变其合成的产物[1 .芪类次生代谢途径中有关 酶如PAL和STS在诱发因子作用下协同表达. Melchior F等口朝将芪合酶分为两类:白藜芦醇合酶 和赤松素合酶,前者主要存在于葡萄(Vitis vinif— era)和花生(Arachis hypogaea)中,以4一香豆酰辅 酶A为底物合成白藜芦醇,而后者存在于欧洲赤松 (Pinus sylvestris)和北美乔松(Pinus strobus)中, 以肉桂酸辅酶A为底物合成赤松素. 由于白藜芦醇的生物合成比化学合成更具有前 景,其合成关键酶的分子生物学研究成了另一个热 点.Schoppner等 0=从花生细胞悬浮细胞液中得到 了二苯乙烯合成酶,分子量为90 000道尔顿,每个 亚基约45 000道尔顿,等电点为4.8.酶对香豆醛或 肉桂酸CoA有高度的选择性,二羟基香豆醛或肉桂 酸CoA与酶的结合效应只有前者的十分之一,乙酰 CoA不能替代丙二酸单酰CoA.G Schroder等[ 从花生悬浮培养细胞中的cDNA 文库中调出这 STS和CHS的cDNA克隆子,序列分析表明:两个 酶作用底物相同,产物各异相同的支架结构负责结 合相同的底物,不同的结构部分催化不同的产物生 成.T Lanz等[1 随即对STS和CHS的6个保守 Cys进行定点突变分析,发现只有169位的Cys对两种酶是必需的,其他Cys的变化都会降低酶的活 性.Cys135和Cysl95可能与两种酶的专一性有关, 生成不同的产物.必需氨基酸Cys周围的氨基酸序 列与其他聚酮合成酶和脂肪酸生物合成酶的活性位 点没有相似之处.表明STS和CTS代表了一组不 同于其他缩合酶的酶类 引.王冰梅等 叼通过对花生 白藜芦醇合酶基因DNA 的克隆,并与几种芪合酶 及查儿酮合酶的DNA 序列比较证实,芪合酶结合 底物的活性中心半胱氨酸(Cys),位置一般为 Cys164或Cys169;芪合酶家族具有特征位点GV— LFGFGPGLT;氨基酸总数在380—400之间,相对 分子量在43 000左右;内含子均为1个,虽然长度 有差异,但内含子的位置几乎从同一位置开始(180 nt附近)等. 2.2 基因工程在白藜芦醇研究中的应用 由于芪合酶在白藜芦醇等芪类次生代谢物生物 合成途径中的重要调节作用,芪合酶的基因工程应 用研究也受到了人们的高度重视,并取得了重要的 进展. 通过基因添加技术将芪合酶基因导人到目标植 物基因组中,可望使转基因植物表达芪合酶活性,启 动芪类次生代谢合成途径,从而改变植物性状. Hain等 构建了花生STS基因与卡那霉素抗性基 因的嵌合基因,并将该嵌合基因转入到烟草原生质 体的基因组中,转化烟草悬浮细胞培养物在真菌细 胞壁诱发因子或紫外线诱导作用下表达STS酶活 性.在紫外线和真菌细胞壁诱发因子处理后10 rain 和30 rain的烟草转化愈伤组织检测出STS的mR— NA.尽管诱导表达的STS酶活性只有花生悬浮细 胞中的十分之一,但这两个系统中STS酶活性表达 的动态特征一致.为了进一步获得具有杀菌能力的 植保素含量水平转基因烟草,Hain等[8 又从葡萄中 分离出STS基因Vst1和Vst2,将Vst1、Vst2基因 与植物选择基因和报道基因连接,一道转入烟草原 生质体基因组,检测再生愈伤组织和再生植株中 STS基因转录、酶活性表达和白藜芦醇表达情况, 表明转化植物在诱发因子作用下外源基因发生了转 录,并表达出STS酶活性.为了检测该策略对于植 物抗病的效果,该研究小组用烟草病原菌灰霉(Botrytis cinerea)侵染烟草,结果表明野生型B.cinere和不表达STS酶活性的对照烟草组合中,烟草不表 现抗性,而24D1的转化烟草表现出持续抗性,而 24D1的转化烟草表现出非持续抗性.分析mRNA 的积累水平,结果表明23D17的最大mRNA 表达 时间比23D1快几个小时,这种表达时间上的差异 可能是由于两株转基因植株在抗性上存在差异.两 株转基因植物的最大mRNA 积累时间与最高浓度 白藜芦醇的出现时间基本一致.该结果说明,通过基 因的添加,使植物合成外源植保素,从而提高了植物 的抗病作用,从技术上来说是可行的[2 .此外,许多 研究者还将STS基因分别转入油菜嘲、水稻 ]、大 麦 ]、小麦 等作物中,均获得了抗病性增强的转 基因植株.例如,转STS基因水稻抗白叶枯病和稻 瘟病水平均有所增强;将葡萄的STS基因Vstl转 入小麦中,可获得5个转化植株,其中2株的T3代 植株中鉴定出1个对白粉病免疫植株和3个对白粉 病中抗的植株,同时证明了葡萄中的芪合酶启动子 在单子叶植物中仍然起作用;Punja将葡萄中的 RS基因分别转入大麦(H.vulgare)、水稻(O.sati— va)和西红柿中,在转基因植物中均检测到RS,对相 应病原菌的抗性也有所提高,其中转基因西红柿对 蔓延疫霉有效,而对灰色 葡萄孢和马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani) 无效;Hipskind和Paiva-2 ]以CaMV35S为启动子, 将花生中的RS基因转入苜蓿(Medicago sativa), 通过HPLC、UV 和NMR分析证明转基因苜蓿中 积累了一种新化合物RGluc(trans—resveratrol一3 一O—B—D—glucopyr,dnoside),另外生物检测的结 果证明RGluc和Res均大大抑制了茎点霉属(Pho— ma)的真菌的生长;Fettig和Hess_2 将嵌合的RS 基因转入两种德国春小麦(Combi和Hanno),通过 RT—PCR证明了RS基因的表达,用HPLC法和 质谱分析法检测到Res,但没有检测到对病原菌的 抗性,进一步的研究证明RS基因在亲本中得到表 达,按孟德尔法分离的两个品种的子一代也表达了 RS基因,同时研究显示RS基因的失活伴随着该基 因的甲基化;中国科学院遗传研究所将葡萄的芪合 酶基因转入水稻 和普通春小麦 均获得了转基 因植株.郭志鸿等成功构建了能在单子叶植物中 持续、高效表达芪合酶基因的植物表达载体pBIUG,并对玉米进行了遗传转化,得到了转化苗.腊 平等 叼构建了含芪合酶基因的植物组成型表达载 体,经农杆菌介导转化了不含芪合酶的植物如烟草, 使转基因烟草获得不经病原菌攻击即可合成反式白 藜芦醇的新特性,从而从中纯化的反式白藜芦醇能 使人乳腺癌细胞停留在G。,G 期的细胞数增加.然 而伴随着RS基因的转入,有的植物体也发生了异 常的反应.Kobayashi等口 从3种葡萄(V.vinif— era,V.1abrusca,V.riparia)中分离到RS基因,在 CaMV35S启动子控制下,由农杆菌介导将它们转 入猕猴桃(Actinidia deliciosa),结果表明该基因的 确在植物体内得到表达,但转化体的叶子中产生的 是云杉新苷(piceid)而不是Res,这可能是由于Res 被该植物内部存在糖基转移酶作用形成了云杉新 苷[3妇;Hipskind和Paiva[弘 在转基因苜蓿中也发现 了上述现象;Fischer等从葡萄中分离到RS基因 并转入烟草中,RS基因得到高效表达,也产生了高 水平的Res,但转基因烟草的花粉失去了生活能力, 而且烟草粉红花色也消失了.然而据报道,目前已获 得的转白藜芦醇合酶基因植物中,除了转基因烟草 中检测到白藜芦醇,转基因猕猴桃(Actinidia deli— ciosa)叶片和苜蓿(Medicago sativa)中得到白藜芦 醇苷,大多数转白藜芦醇合酶基因的植物如小麦、大 麦、水稻都没有检测到白藜芦醇.因此,提高转基因 植物中的白藜芦醇含量具有重要意义. 结构基因的基因工程中,启动子是影响基因表 达时间、部位、效率及对不同诱发因子响应,从而影 响转基因植物应用价值的一个重要因素.在芪合酶 基因工程中,最近有人应用高效诱导型启动子,取得 了良好的效果.在葡萄中白藜芦醇虽是一种主要植 保素,但随着葡萄的成熟,即使在病原菌的侵染作用 下,其合成白藜芦醇的能力也会下降,白藜芦醇在葡 萄成熟后期抗病作用也因此而下降.利用苜蓿 PR10诱导型启动子与葡萄芪合酶1(Vst1)构建嵌 合基因导入到葡萄中,分析所获得的5O个转基因植 株,发现其中一部分白藜芦醇含量较对照低,另一部 分转基因植株白藜芦醇含量是对照的5~100倍,这 部分植株在病原菌侵染作用下的病害症状也大大降 低.表明病原菌诱导型启动子与防御基因的结合应 用是作物抗病基因工程的有效途径 ].迄今有关芪合酶基因工程研究的目标主要是植物抗病的遗传改 良,而有关芪合酶基因工程在植物营养、品质改良方 面的应用还未见到报道. 2.3 细胞工程在白藜芦醇研究中的应用 随着现代生物技术的飞速发展,利用植物细胞 克隆技术为昂贵重要资源的工业化生产提供了可 能.该技术以高产植物中大规模培养为核心,具有生 产成本低、产品品质好、不破坏自然资源等优势,为 白藜芦醇产业化提供了新途径.早期对RS的诱导 研究主要在于用紫外光处理幼嫩的植物或种子,随后人们逐渐建立了植物细胞培养的研究体系,细 胞悬浮培养的应用更为广泛,尽管它不能考虑到整个诱导过程的方方面面,但却大大方便了在酶学和 mRNA水平上的研究工作.国内西北大学生命科学学院首先论证了植物组织培养生产白藜芦醇新 方法在理论上的可行性:白藜芦醇的产量是直接提 取的1.5~3倍,生产不受季节的限制,可以人为地 调控植物组织的生长周期.在此基础上,为了进一步 提高白藜芦醇的产量,郭斌[3 利用He—Ne激光辐 射用根癌农杆菌株感染过的葡萄皮脱分化组织,进行诱变处理,通过继代选育得到了遗传性状稳定、生 长迅速、生长周期短、高产白藜芦醇的优良细胞系. 国外在此方面的研究报道也较多,Tanoh Hi laire等首次在棉花coker36的悬浮细胞系中检测 到了反式白藜芦醇;Annalisa Tassoni[3 等研究了 茉莉酮酸酯、甲基茉莉酮酸酯以及原钒酸钠在葡萄 悬浮培养过程中对白藜芦醇含量的影响,结果表明, 这几种外源物质均可以有效地促进白藜芦醇的积累和释放.Vitis amurensis Rupr的细胞系和以往报道 中其他葡萄品种的细胞系相比,其中白藜芦醇含量 最低,K.V.Kiselev等。 将rolB基因转入其细胞 系中,白藜芦醇含量增加了100多倍,从之前的 0.026% 上升到3.15%. 3 小结 我国富含白藜芦醇的野生植物资源丰富,但是 在利用先进技术生产白藜芦醇或增加其含量等方面 的研究较为滞后,为充分发挥我国的资源优势,应从 以下几个方面加强对白藜芦醇的研究与开发:一是 挖掘富含白藜芦醇的植物品种或通过人工栽培、育种手段获得高白藜芦醇含量的品种,并通过诱导提 高葡萄、花生等植物中白藜芦醇的含量,利用植物细 胞克隆技术筛选白藜芦醇的高产细胞系;二是将芪 合酶基因转入水稻、小麦、大豆等重要粮食作物和经 济作物中,提高转基因植物抗病原体的能力,同时提 高农作物的营养价值;三是要不断深化对获得高含 量白藜芦醇的不同工艺方法的研究,提高原料利用 率,增加产品的附加值;四是加强白藜芦醇的综合开 发利用,提高其市场综合利用价值,并保护白藜芦醇 资源的可持续开发利用. |