丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在细胞内发挥重要作用,包括细胞外调节蛋白激酶 (ERK)、c—Jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)三条经典的亚族通路 J,其被脂多糖(LPS)等多种因素激活后可产生大量炎性介质,促进炎症发生、发展,活化标志是蛋白磷酸化形式表达量增多。目前白藜芦醇因具有可靠而广泛的抗炎作用日益受到重视,但具体机制尚未清楚。RAW264.7细胞为小鼠巨噬细胞系,常用于细胞炎症方面的研究。2010年2月,我们观察了白藜芦醇 对RAW264.7细胞中LPS激活MAPK炎症通路的影响,旨在进一步探讨其抗炎机制。
1 材料与方法
1.1 材料RAW264.7细胞株(中国科学院上海细胞库),DMEM高糖培养基、青霉素—链霉素双抗,血清,LPS,p38 MAPK、ERK、JNK及其磷酸化蛋白P— p38 MAPK、P.ERK、P JNK一抗和二抗,白藜芦醇,内参B—actin一抗、二抗,细胞计数试剂盒(CCK一8),电泳缓冲液、RIPA细胞裂解液、蛋白上样缓冲液、BCA 试剂盒。
1.2 不同浓度白藜芦醇及LPS处理后RAW264.7 细胞活性测定将RAW264.7细胞悬液100 l按1 ×10 /ml密度接种至96孔板中,置于37℃、5% CO 培养箱中孵育24 h,至细胞良好贴壁后随机分为空白对照组和处理组,每组设5个复孔。其中处理组分别加入不同浓度的白藜芦醇(5、10、15、30 M)+LPS共同孵育,24 h后各组每孔加入CCK一8 溶液10 l孵育2 h,用酶标仪在450 nm处检测各孔吸光度(OD)。设仅加入DMEM培养基100 IXl者为调零组,空白对照组和处理组的细胞活性分别以其与调零组OD差值表示。
1.3 不同浓度白藜芦醇及LPS处理后RAw264.7 细胞MAPK蛋白水平检测① 白藜芦醇及LPS处理:将RAW264.7细胞随机分为对照组、LPS组、 LPS+白藜芦醇组,均加入含10%FBS、100 U/ml青霉素、链霉素双抗的高糖DMEM培养基,于37℃、 5%CO:下以1.5×10。/ml的密度接种于培养皿中,待细胞贴壁良好且生长融合至约90% 时,LPS+白藜芦醇组加人适当体积的白藜芦醇使其浓度梯度分别为5、10、15 IXM,2 h后LPS组和LPS+白藜芦醇组分别加入LPS至其终质量浓度为1 g/ml,培养 30 rain。②MAPK蛋白水平检测:RAW264.7细胞经上述处理后,用冰冷PBS清洗终止反应,加入含有磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,将细胞从培养皿刮离、冰上裂解30 min,取上清加上样缓冲液,沸水中煮10 rain使蛋白变性,一20℃保存。配置SDS— PAGE凝胶,各个泳道蛋白等量上样均为30 ,电泳结束后切胶、转膜、封闭、孵育一抗过夜,孵育二抗,ECL发光试剂盒发光显影和压片,Western条带用Quantity ONe软件扫描灰度,用内参灰度值进行校正。上述实验均重复3次。
1.4 统计学方法用SPSS 13.0软件行统计学处理。计量数据以 ±s表示,采用One—way ANOVA 方差分析,P≤O.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 三组RAW254.7细胞活性 空白对照组为 1.107 0±0.111 70,处理组白藜芦醇浓度为5、lO、l5、 30 IxM者分别为1.400 8±0.126 04、1.227 1±0.203 41、1.172 7±0.156 58、0.695 6±0.047 13,白藜芦醇 浓度为30 IxM处理组细胞活性显著低于其他浓度处理者及对照组,P<0.05(F=10.625)。
2.2 三组MAPK磷酸化蛋白水平见表1。
3 讨论
MAPK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,能够将胞外刺激信号转导成胞内的转录和翻译后效应。激活的MAPK可通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白、酶类等多种底物来调节炎症、疼痛等多种病理生理过程。白藜芦醇是虎杖的有效成分之一,具有保护心肌细胞、改善微循环、抑制血小板聚集、抵抗内毒素休克、降血脂、抗脂质过氧化及镇咳、平喘、抗病原微生物等多种药理作用。MAPK蛋白是否为白藜芦醇抗炎的直接作用靶点,既往少有研究。本研究显示,白藜芦醇浓度在5—15 IxM时对RAW264.7细胞活性无明显影响,达30 txM时可使细胞活性显著降低。故本研究中选择5—15 IxM白藜芦醇进行后续实验,结果显示其可抑制MAPK家族中p38 MAPK、JNK 磷酸化,而对ERK磷酸化无明显影响。提示抑制 MAPK炎症信号转导通路可能为白藜芦醇抗炎机制之一,但该作用为直接I生或问接陛尚需进一步研究和证实。Nonn等 对前列腺腺上皮细胞的研究表明,白藜芦醇可上调细胞丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶5 水平,抑制IL。l、TNF一仪诱导的p38 MAPK炎性信号转导通路的激活,减少COX-2、IL-6、IL-8的产生。另有研究表明,白藜芦醇可通过各种机制抑制NF.KB,减少炎性细胞因子的产生 J,从而发挥抗炎作用。因 NF .cB很可能为MAPK的下游,白藜芦醇的抗炎效果很可能是通过抑制MAPK—NF—KB通路实现的。
总之,5~15 IxM 白藜芦醇可抑制LPS激活的 p38 MAPK、JNk磷酸化,此可能为其抗炎机制之一。 |