白藜芦醇对白血病小鼠抗肿瘤免疫学的初步实验研究 |
发布时间:2013-12-10 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2123 |
白血病是一种常见的造血组织恶性疾病,起源 于造血干细胞的基因突变。由于白血病细胞在髓腔内迅速增殖,抑制了正常造血,导致三系血细胞异 常。虽然白藜芦醇的抗肿瘤作用已经在诸多细胞系 中得到证实,但是具体应用剂量在不同的研究中存 在较大差异。鉴于白藜芦醇的抗肿瘤研究主要在体 外进行,而它必须通过体内代谢活化或机体反应才能发挥作用,因此,体外的药效结果在体内不一定都 能相对应。阐明白藜芦醇免疫调节作用的具体分子 机制,是对其开发利用及理论研究的重要前提之一。 本课题选择白血病腹水瘤小鼠作为研究对象,初步 探讨白藜芦醇对白血病机体免疫功能的影响及其作 用机制。 1 材料和方法 1.1 材料白藜芦醇(纯度98.36%),MTr购于Sigma公司,RPMI 1640、胎牛血清(FCS)购于Gibco公司,抗鼠CD3一 PE—cy5、CD4一FITC、CD8一PlE购于Ebioseienee公 司,小鼠淋巴细胞白血病细胞株(L1210)由西安交通 大学生命学院王一理老师惠赠。Balb/c小鼠,6周 龄,雄性,体重(20±2)g,西安交通大学医学院实验 动物中心提供(动物合格证:sYxK(陕)2007—003) 1.2 方法 1.2.1 动物的分组及模型建立 Balb/c小鼠随 机分为6组,每组10只。具体分组如下:阴性对照 组(腹腔内注射生理盐水),左旋咪唑阳性对照组, L1210组(荷瘤组),L1210+白藜芦醇高剂量组, L1210+白藜芦醇中剂量组,L1210+白藜芦醇低剂 量组。结合白藜芦醇药理学特点,参照小鼠口服 用量,将白藜芦醇的用药浓度定为高剂量50 mg/ (kg·d),中剂量25 mg/( ·d),低剂量l2.5 nag/ (kg·d)。均每日清晨8时灌胃,每次0.2 ml,连续灌 服三周。阳性对照为肿瘤接种第二天起,腹腔注 射左旋咪唑2.5 mg/(kg·d),连续10 d为一疗 程l 。连续给药5 d后,腹腔接种L1210细胞(1× lO6 5 X 106个/m1),0.2 ml/只。接种后继续给药 16 d。瘤种接种按《全国抗肿瘤药物体内筛选规 程》的方法进行 2。肿瘤接种后第3天起,每日眼 眶静脉丛采血进行外周血白细胞计数及血涂片, 瑞一吉染色找白血病细胞,证实小鼠发病,模型建 立成功。 1.2.2 白血病小鼠T淋巴细胞功能测定无菌取 脾,制备淋巴细胞,可作为T淋巴细胞悬液,用含 10%胎牛血清RPMI 1 640培养基调细胞浓度2× 106/ml ,加入96孔培养板,设三复孔(前三孔为对照 孔,后三孑L为实验孔,加含10 t,e,/ml Con A的细胞培 养基),37℃,5% co2培养72 h,弃上清,加5 mg/ml mT,继续培养4—6 h,加人DMSO混匀,570 nln波 长测定OD值,结果用刺激指数(SI)表示。SI=实验 孔OD值 照孔OD值。 1.2.3 白血病小鼠B淋巴细胞功能测定L3J 取B 细胞,与LPS(10 t~g/mi)在37oC,5%co2培养箱中培 养7 d,吸去上清,取细胞悬液涂片,冷丙酮固定10 min,滴加FITC一标记的抗鼠Ig抗体,室温,避光孵 育60 min,荧光显微镜观察,计数阳性细胞百分率。 1.2.4 白血病小鼠NK细胞杀伤活性检测 将靶 细胞(YAC一1细胞)用含10%胎牛血清的RPMI 1 640培养基调至1 X 105/ml,分离小鼠脾细胞,调细胞 浓度至1×106/mi,作为NK细胞的来源。取96孔细 胞培养板,对照组分别加靶细胞、效应细胞,再加完 全RPMI 1 640培养基;实验组为效应细胞+靶细胞 (效:靶为10:1),37~C,5% coz培养4 h,加5 mg/na MTr溶液继续培养4 h,加入DMSO于570珊处测 定OD值。结果判定:NK细胞杀伤活性(%)=[ODr 一(ODs—ODE)]/(OOr)X 100% (注:ODT为靶细胞的OD值,ODs为检测细胞的 OD值,ODE为效应细胞的OD值) 1.2.5 流式细胞术检测小鼠T细胞亚群纯化T 淋巴细胞与CD3一PE—Cy5、CD4一FITC以及CD8一 PE共同孵育15 min,离心各组样品,弃上清,加入 500 固定剂,用Beeton Dikinson公司FACSCalibur 型流式细胞仪上机分析cD4 /cD8 T淋巴细胞亚群。 1.3 统计学处理所有数据均用SPSS13.0统计软 件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析 (one way ANOVA),方差不齐组经数据转换后再行方 差分析。两样本间比较以Bonferroni t检验。 2 结 果 2.1 白藜芦醇对白血病小鼠存活时间的影响 白藜芦醇能明显改善荷瘤小鼠的生存状态、延长 白血病小鼠的存活时间,同时明显减轻小鼠肝脾 组织中白血病细胞的浸润程度及外周白细胞数 (数据未显示)。根据Kaplan—Meier曲线评价白藜 芦醇在体内对白血病小鼠存活时间的影响。如图 1所示,灌服白藜芦醇后,荷瘤鼠的生存期延长, 中、高剂量组的存活时间明显长于荷瘤对照组(P <0.01),低剂量白藜芦醇组与对照组相比差异无 统计学意义(P>0.05)。 2.2 白藜芦醇对白血病小鼠T淋巴细胞增殖的影响 T淋巴细胞经Con A刺激后的增殖反应:与正 常对照相比,荷瘤对照组小鼠sI显著降低,而白藜 芦醇处理组小鼠T淋巴细胞对Con A刺激的增殖反 应明显增强,且呈剂量依赖性 2.3 白藜芦醇影响白血病小鼠B淋巴细胞内Ig的 产生能力 荷瘤组小鼠抗体产生细胞数明显少于正 常组,不同剂量白藜芦醇干预后,荷瘤小鼠B淋巴 细胞的抗体产生能力得到不同程度的增强,呈一定的剂量依赖性,与荷瘤对照组相比,有显著性差异)。 2.4 白藜芦醇增强白血病小鼠NK细胞杀伤活性 荷瘤组小鼠NK细胞杀伤活性减弱,与荷瘤对照 组相比,白藜芦醇能明显增强白血病腹水瘤小鼠的 NK细胞杀伤活性,且该作用呈剂量依赖性(表1)。 2.5 白藜芦醇增加白血病小鼠CD4/CD8比例 25 mg/kg和50 mg/kg剂量组的白藜芦醇能明显增加白 血病荷瘤小鼠CIM/CD8比例,与荷瘤对照组比较有 明显差异。而12.5 mg/kg白藜芦醇组与荷瘤对照 组相比,差异没有显著性。 上述各指标的检测中,阳性对照组与高剂量组 相比无显著性差异(数据未显示)。此外,本研究同 期设置了三组正常对照鼠分别给予相应剂量的白藜芦醇,观察其对正常小鼠是否有不良影响。结果可见三组正常对照小鼠接受白藜芦醇处理后未发现有 何不良反应(数据未显示)。 3 讨 论 白血病的常用治疗方法为化学治疗,但是化疗 药物对肿瘤细胞缺乏特异性的选择作用,在杀伤肿 瘤细胞的同时,往往也杀伤正常细胞,给机体的正常 组织器官,特别是骨髓和消化道造成功能性或器质 性的损伤。此外,白血病细胞对化疗药物的耐受性 也是化疗失败的主要原因之一。白藜芦醇是一种 活性多酚物质,富含于多种中药材植物中,具有抗肿 瘤、抗炎、肝脏保护、免疫调节等作用,特别是对造血 系统毒性小的特征,使人们推测它在白血病的治疗 中具有潜在的应用价值。为了进一步明确白藜芦 醇在体内是否也具有延缓、抑制或者逆转白血病进 程的作用,本课题采用移植性肿瘤小鼠模型加以验 证。由于荷实体瘤小鼠的存活时间较腹水型长3个 月左右,影响生存期的因素较多,所以本课题选择 L1210小鼠白血病细胞建立腹水型肿瘤模型,探讨白藜芦醇抗白血病作用的分子免疫学机制。 本研究观察到,白藜芦醇通过增加荷瘤小鼠 cD4 /CD8 比率、Con A诱导的T淋巴细胞增殖、NK 细胞杀伤活性以及B淋巴细胞内Ig产生能力,发挥 抗白血病作用,且该效应呈剂量依赖性。这些实验 结果说明,白藜芦醇对白血病小鼠具有免疫增强效 应,并且能明显改善白血病机体的免疫低下状态。除了免疫刺激作用外,白藜芦醇使白血病小鼠B淋 巴细胞k产生能力增强的原因可能与其诱导造血 细胞生成、促进淋巴细胞增殖有关。需要注意的是, 虽然本研究结果显示自藜芦醇能提高T淋巴细胞增殖,但是由于T淋巴细胞的活化增殖是一个极其复 杂的动态过程,受多种调控因素的影响,因此,白藜 芦醇对T淋巴细胞的作用机制还有待于进一步深入 研究阐明。本研究中,白藜芦醇体内抗肿瘤免疫作 用的量效关系呈线性模式,与Feng等l6』的研究结果 相一致。然而与此矛盾的是,有报道称白藜芦醇能 抑制NK细胞的细胞毒作用,或者减少T淋巴细 胞数量。这些相互矛盾的研究结果,或许由于采用的实验体系不同造成的。 值得一提的是,研究人员还发现白藜芦醇的免 疫调节作用具有双相性:即不同的研究条件可导致 白藜芦醇从无作用到免疫增强或者免疫抑制。这种 双向调节效应可能对于清除宿主突变细胞、控制过度活化的免疫应答以及抗移植排斥反应等方面具有深远的应用价值。 本研究从免疫学角度探讨了白藜芦醇的抗白血 病作用,结果表明,白藜芦醇能明显改善荷瘤小鼠的 生存状态、延长白血病小鼠的存活时间,并且通过增 强荷瘤机体的细胞、体液免疫功能,改善白血病小鼠 的免疫低下状态,发挥抗白血病作用。
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