山茱萸(Cornus officinalis Sieb．et Zucc)属山茱萸系山茱萸科植物，是一种重要 的野生资源．其果肉味酸、涩，微温，归肝肾经，有补益肝肾、涩精固脱的功效，是中医临床常 用的传统抗衰老药物之一，主要功能成分为环 烯醚萜类、皂苷、多糖、熊果酸、齐墩果酸、鞣质等．

 熊果酸(ursolie acid，UA)，是一种弱极性的五环三萜酸， 分子量为456．68，溶点285～287℃ ，易溶于二 氧六环、吡啶，可溶于甲醇、乙醇、丁醇，略溶于 丙酮，微溶于苯、氯仿、乙醚，不溶于水和石油醚．研究表明，熊果酸具有较高的生物学活性， 包括抗癌、对肝损伤的保护、抗菌消炎和抗病毒等作用．熊果酸具有较高的医用价值和保健功能，有广阔的市场前景，所以熊果酸的提取越 来越受到广大科研学者的关注．

 山茱萸中熊果酸的提取方法有多种，如索 氏提取法、超声波提取法、乙醇回流提取法、超 临界流体萃取法(SFE)等．其中超声波提取法是利用超声波强大的空化作用使细胞壁破碎， 强化传质，能显著提高熊果酸的提取效率．在原料中加入酵母菌，利用其酵解糖分的特点，分 解山茱萸中的糖类，充分消除影响提取过程及 效率的杂质．由于熊果酸属于萜类，不会因酵母 发酵而影响得率和性质．降低山茱萸中的糖分，不但可以简化提取工艺，而且还可以提高粗提 物中熊果酸的含量．迄今为止，有关酵母除糖结合超声波辅助提取技术应用于山茱萸中熊果酸 提取尚未有文献报道．

 1 材料与方法

 1．1 材料

 山茱萸干燥果实产于浙江省临安市，由杭 州天目生物科技有限公司提供．酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，由安琪酵母股份有限公司生产；熊果酸对照品购于中国药品生物制品鉴定所；甲醇为国产色谱纯，其余均为国 产分析纯．

 1．2 仪 器

 KYC100B型摇床(上海福玛实验设备有 限公司)；WYT型糖量计(福建省泉州市万达实验仪器设备有限公司)；KQ2200DB型数控 超声发生器(江苏省苏州市昆山市(县)超声仪器有限公司)；岛津LC一20A型高效液相色谱仪 (日本岛津公司)；DZX一6090真空干燥箱(上海 福玛实验设备有限公司)．

 1．3 方 法

 1．3．1 山茱萸提取工艺流程 山茱萸浆(山 茱萸干粉+水)一发酵除糖一加酒精一超声提取一过滤(弃去滤渣)一浓缩一减 压干燥一初制品．

 1．3．2 材料预处理

 1．3．2．1 山茱萸发酵．称取20 g粉碎过的山 茱萸干燥果实，置于三角瓶中，加入40 mL水， 搅匀，沸水浴加热．

 干酵母活化：按设定条件，称取一定量干酵 母，加入1O倍质量的水，40℃ 加热15 rain，转 移至3O℃ 的水浴锅中，待酵母液体冷却，转入 三角瓶中，用牛皮纸封闭瓶口，置于摇床上，在 设定条件下发酵．

 1．3．2．2 发酵液糖分含量测定．每隔12 h用 糖量计测量发酵液的糖度，记录发酵液糖度的 变化．

 1．3．2．3 发酵条件的选择．本实验对发酵温度、酵母接种量、摇床转速进行单因素探索，分 别考察3个因素对原材料最终糖度和发酵速度 的影响．

 1．3．3 山茱萸中熊果酸提取方法 发酵完 毕后，发酵液加入800 mL不同浓度的酒精，置 于超声发生器中，控制提取温度、超声波功率和提取时间，提取液过滤后定容于1000 mL的容 量瓶中．

 1．3．4 提取液中熊果酸含量测定

 1．3．4．1 色谱柱条件．色谱柱Hypersil C 8(25 cmX4．6 mm，粒径5 m)；流动相：甲醇一水一磷 酸(90：10：0．1)；检测波长215 nm，流速1．2 mL．min_1；柱温：室温．熊果酸对照品和山茱萸的HPLC图谱见图2，添加回收率为94．2 ．

 1．3．4．2 对照品溶液制备．精密称取干燥至恒重的熊果酸对照品2 mg，用色谱纯甲醇溶 解，溶液中熊果酸最终浓度为1 mg．mL，以 微孔膜过滤，置于冰箱内冷藏保存，待用．

 1．3．4．3 样品液制备．取1 mL定容后的提取 液，用色谱纯甲醇稀释至10 mL，以微孔膜过 滤，作为供试品溶液．

 1．3．5 正交试验方案设计 在预备实验的 基础上选取对熊果酸浸提率影响较大的4个因 素进行正交试验：酒精浓度，超声波提取温度，超声波功率，超声波提取时间．

 1．4 熊果酸得率计算

 X==：(A样×G际XV)÷(A标×Ml原材料)×100 ， 式中A样为初制品峰面积；A标为对照品峰面 积；C标为标准品浓度；V为初制品溶解后溶液体积；M原材料为山茱萸干粉质量；X 为熊果酸 得率／ ．

 1．5 数据处理

 本实验数据用Origin pro 7．5版处理，实 验重复3次．

 2 结果与讨论

 2．1 发酵对山茱萸浆糖度的影响

 接种酵母于山茱萸浆中，在酵母最适生长 条件下进行发酵．发酵前山茱萸浆的糖度为 20 ．由图3可知，对照组糖度随发酵时间变化 不显著，而接种组的山茱萸浆糖度从第2 d开始变化显著，到第3 d变化极显著，第4 d到第 6 d其变化维持在较高水平，随后变化显著性 明显减弱，第8、9两天相比糖度变化无显著性， 维持在8 ．可见通过发酵能明显降低山茱萸 浆的糖度．

 2．2 发酵条件的选择

 发酵条件的选择主要通过考察温度、接种 量和摇床转速3个因素对发酵速度(用1／T表 示，T代表发酵天数)和发酵液最终糖度2个指标的影响来实现．试验结果表明，不同发酵处理 最终糖度均介于7 ～8 之间，变化不明显．

 2．2．1 发酵温度的选择 控制摇床转速150 r．min，接种量3：80，比较摇床温度在 20、25、30和35℃ 下的发酵速度．

 温度是影响发酵的主要因素之一，根据发 酵第一定律 ]，在某一温度范围内，发酵速度和 温度成正比，每增加1O℃ ，发酵速度将增加1 倍．当温度超过酵母生长最适宜温度时，高温对 酵母的生长会产生抑制作用．由图4可知，发酵 速度随着摇床温度上升逐渐提高，到3O℃时达 到最高，温度再继续升高到35℃ 时，发酵速率 有所降低．可见当摇床温度设为3O℃时发酵温 度接近酵母生长最适温度，发酵速率最快．

 2．2．2 接种量的选择 控制发酵温度3O ℃ ，摇床转速150 r．rain，考察酵母接种量对 发酵时间的影响．

 接种量是影响酵母发酵速度的因素之一． 酵母生长有4个时期，即迟滞期、对数期、稳定 期和衰老期，其中迟滞期糖分分解速率比较低，稳定期最高．而接种量的多少直接影响到酵母 生长迟滞期的长短，接种量越多迟滞期越短，进 入稳定期所用时间越短，达到糖分最大分解速 率所用时间就越短．由图5可知，发酵速率随着 接种量的增加而增加，但是增加的趋势逐渐减 小，当接种量为3：80和4：8O时，发酵速率差别已经不明显．综合考虑时间和成本2个因素， 选择生产用量为3：80．

 2．2．3 摇床转速的选择 控制发酵温度3O ℃ ，接种量3：8O，考察摇床转速对发酵时间的 影响．

 摇床转速也是影响发酵的重要因素之一． 摇床摇动对发酵的有利影响主要有2个方面：其一是通过摇床摇动能够使发酵液中氧气含量升高，有利于酵母代谢，加速糖分降解；其二是 通过摇床摇动能够使酵母充分与发酵液混合， 使发酵更加充分．但并非转速越高发酵速率越 高，在发酵液氧气含量充足和酵母、发酵液混合充分的条件下，酵母已经达到最适生长状态，增 加转速，发酵速率将不会提高．由图6可知，发 酵速率随着摇床转速增加而增加，但是增加的趋势趋于平缓．当转速从150 r．min 增加到 170 r．min 时，发酵速率的增加已不明显．可见，转速控制在150 r．rain 最合适．

 2．3 熊果酸提取工艺参数的确定

 2．3．1 正交因素水平表设计 选择酒精浓 度(A)、超声波提取温度(B)、超声波功率(C) 和超声波提取时间(D)4个因素，利用4因素3 水平正交试验分析上述4种因素对山茱萸中熊 果酸提取效果的影响．

 2．3．2 正交试验结果 在单因素试验基础上，设计L(3 )正交试验．

 由表可知，超声提取温度和超声功率的 极差值较大，两因素对熊果酸的提取影响比较大，而酒精浓度和提取时间极差值相对较小，对 熊果酸提取影响不明显．各因素对熊果酸提取 影响的大小次序为：B(超声波提取温度)>C (超声功率)>A(酒精浓度)>D(超声波提取 时间)．最佳提取方案为：ABCD，即酒精浓 度85 ，提取温度50℃ ，超声功率100 W，超 声时间30 rain．追加试验结果表明，在此条件 下熊果酸的浸出率为0．2512 ．

 2．4 熊果酸得率及分析

 通过HPLC法测定，计算出在最优工艺条 件下熊果酸得率为0．2512 ．该工艺的熊果酸 得率明显高于其他方法，如索氏提取法提取率 1．82 mg．g [73(得率为0．182 )，超声波提取法提取率1．84 mg．g (得率为0．184 )，乙 醇回流提取法提取率2．2 mg．g _8 (得率为 0．22 )．该工艺之所以有高的熊果酸得率，主要有2个方面的原因：一是通过发酵预处理酵 母代谢掉了原料中大量糖分，有助于熊果酸的溶出；二是合适条件下的超声波处理使植物细胞最大程度的破碎，使熊果酸能最大程度的和 提取剂接触，降低了熊果酸溶出的阻力．

 3 结 论

 3．1 山茱萸中熊果酸的最佳提取工艺及熊果酸得率：发酵参数为发酵温度30℃ ，酵母菌接 种量和原料比值3：80，摇床转速150 r． rain_。，时间5 d．超声波提取参数为酒精浓度 85 ，提取温度50℃ ，超声功率100 W，提取时 间30 rain．熊果酸得率为0．2512 ．

 3．2 酵母发酵法除糖是利用酵母菌能对糖及 其衍生物降解，在合适的工艺参数下，该方法能 显著降低山茱萸的糖度而不影响熊果酸含量．

 3．3 超声波辅助提取法能够提高提取率的主 要原因是超声波产生的空化效应_8j，能有效破 碎细胞壁，增大细胞的通透性，强化传质，从而提高提取效率．超声波法提取熊果酸，在合适的 工艺参数下提取时间短、提取温度较低、收率高、快捷、简便易行．

 3．4 超声波辅助发酵法提取熊果酸工艺能显 著提高熊果酸得率，降低提取过程中的处理难度，方法简便易行，为熊果酸提取提出了新思 路，也为山茱萸综合利用奠定了基础．