恶性黑素瘤是一种起源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤,易转移,病死率高,目前恶性黑素瘤的治疗模式提倡采用多学科的综合治疗,传统中草药以其不良反应低、安全有效的特点逐渐成为研究的热点之一。和厚朴酚是中药厚朴的主要有效成分之一,近年来研究发现和厚朴酚对多种恶性肿瘤均有一定的拮抗作用,其抗肿瘤效应具有多靶点、多途径、不良反应低的特点,但有关和厚朴酚对黑色素瘤细胞作用的报道甚少。本研究旨在探讨和厚朴酚在体外对人黑色素瘤 A375细胞增殖和凋亡的影响,为其应用于恶性黑素瘤的治疗提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料:①药品和试剂:和厚朴酚购自西安天一生物技术有限公司(批号:20080112,纯度>99%);人黑色素瘤A375细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所;二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(M,I1t)购自美国Sigma:公司;RPMI1640培养液购自美国Gibco公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; Annexin—V—FITC(PI)双染色试剂盒购自上海美季生物技术有限公司;和厚朴酚用DMSO溶解,0.221xm尼龙滤膜过滤除菌,母液浓度为lOOm#ml,一20%避光保存,临用前用RPMI1640培养液稀释成所需浓度(DMsO 浓度≤0.1%);②主要仪器:FASCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品;E1x800酶标仪为美国BioTek公司产品;尼康TE2000倒置相差显微镜为日本Nikon公司产品。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养:将A375细胞置于37℃ 、5%CO2的孵箱中常规培养,培养液为含10% 小牛血清、pn值 7.4的RPMI1640。每隔48h换液1次,以l:5的比例传代。
I.2.2 MqT法检测细胞增殖抑制率:取对数生长期 A375细胞,以RPMI1640培养液制成1×10 /ml细胞悬液接种于96孔板上,200 孔。培养24h,待细胞贴壁后吸除原培养液,实验组每孔分别加入200 不同浓度的和厚朴酚(终浓度2.5、5、10、20、40、8O m1),对照组加等量不含和厚朴酚的RPMI1640培养液,每组设6个复孔。分别将每组细胞培养24、48 72、96h后,进行MTr实验。每孔加入20 MTr (5mg/m1),再培养4h后吸去上清液,每孔加 150~1DMSO,振荡10min,酶标仪测492nm吸光度(A) 值。按下列公式计算细胞增殖抑制率,并绘制浓度、时间效应曲线。细胞增殖抑制率:(对照组A值一实验组A值)/对照组A值×100%。
1.2.3 细胞形态学观察:取对数生长期A375细胞,以RPM11640培养液制成l X10 /ml细胞悬液接种于6 孔板上,1m1/孔。培养24h后吸除原培养液,实验组分别加入1ml不同浓度和厚朴酚(终浓度5、10、2O~g/ m1),对照组加等量不含和厚朴酚的RPMI1640培养液。继续培养48h,倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。
1.2.4 流式细胞仪检测凋亡率:取对数生长期A375 细胞,以RPMI1640培养液制成1×10。/ml细胞悬液接种于24孔板上,1ml/~L。培养24h后吸除原培养液,实验组每孔分别加入1ml不同浓度和厚朴酚(终浓度 5、10、20~g/m1),对照组加等量不含和厚朴酚的RP-MI1640培养液,每组设3个复孔。分别培养48h后,离心收集细胞,预冷的PBS洗涤2次,加结合缓冲液调细胞密度至1x10 /ml,取100~1—5ml培养管内,加人Annexin-V—FITC液5 l和PI液5 ,4℃ 避光反应 30min,上机检测分析细胞凋亡率。
1.3 统计学方法:数据均以均数±标准差(元±s)表示,用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。
2 结果 2.1 和厚朴酚对A375细胞增殖的影响:除2.5i~g/ml 和厚朴酚作用24、48、72h外,其余各点的抑制率与对照组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。而且随着和厚朴酚浓度的增加和作用时间的延长, A375细胞的增殖抑制率也逐渐升高,抑制作用呈现明显的浓度和时间依赖性。 2.2 和厚朴酚作用后A375细胞形态学变化:3个浓度的和厚朴酚(5、10、20txg/m1)作用A375细胞48h 后,相差显微镜下可见细胞变小,多呈类圆形,胞质浓缩,胞质中颗粒明显增多,核固缩和核碎裂,可见凋亡小体,部分细胞漂浮于培养液中;而对照组细胞贴壁牢,细胞形态正常,细胞质中颗粒很少,未见凋亡小体。 2.3 和厚朴酚对A375细胞凋亡率的影响:5、1O、 20txg/ml的和厚朴酚作用A375细胞48h后,凋亡率分另U为(7.27±1.72)% 、(9.85±2.31)%、(12.54± 2.93)% ,对照组凋亡率为(1.54±0.41)%,3个浓度组的凋亡率与对照组相比,差异均有统计学意义(均P <0.05),但不同浓度组之问相比,差异均无统计学意义(均P>0.05)。
3 讨论 和厚朴酚是从木兰科植物厚朴的根皮、枝皮中提取分离的一种带有烯丙基的连苯二酚类化合物,具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗心律失常、抗癫痫等多种生物活性¨ J。随着研究的深入,人们逐渐发现和厚朴酚对白血病、肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤均具有拮抗作用,其抗肿瘤机制可能与抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、干扰相关信号传导通路、抑制肿瘤细胞的转移等多种因素有关。 目前已有大量体内外研究证实,和厚朴酚可以抑制胃癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、血管平滑肌细胞 等多种肿瘤细胞的增殖,并诱导其发生凋亡。同时,对和厚朴酚的研究还发现它对纤维母细胞和淋巴细胞没有明显的细胞毒作用,对这两种细胞的安全剂量可达到40lxg/mlr 。本研究结果显示,小剂量(5~g/m1)的和厚朴酚即对A375细胞的增殖有明显的抑制作用,并呈现明显的浓度和时间依赖性,而且小剂量的和厚朴酚即能使A375细胞的凋亡率明显增高,提示和厚朴酚对A375细胞增殖和凋亡的影响具有不良反应低、安全有效的特点。 细胞的增殖、凋亡均是细胞周期依赖性的,细胞周期的失控是肿瘤发病中极其重要的环节,抑制细胞周期进展是抗肿瘤治疗的重要途径之一。已有研究发现,和厚朴酚可通过诱导乳腺癌细胞 、血管平滑肌细胞阻滞于G,期而抑制细胞增殖并诱导凋亡。
Dikalov等研究发现和厚朴酚可清除黑色素瘤细胞内的过氧化物,这些过氧化物是核因子一KB(nuclearfactor kappa gene binding,NF—KB)主要的生理学刺激物,提示和厚朴酚可阻断黑色素瘤细胞内的NF.KB信号通路。而NF-KB在恶性黑素瘤组织中的处于过度活化状态,可通过上调下游靶基因细胞周期蛋白D1 (CyclinD1)的表达,促进G /S期转换而加速细胞的增殖。由此我们推测,和厚朴酚可能是通过阻断NF—KB 信号通路,下调CyclinD1的表达,诱导细胞周期阻滞于G。期,从而抑制A375细胞增殖并诱导凋亡。
综上所述,小剂量的和厚朴酚即能有效抑制A375 细胞增殖,并诱导其发生凋亡,这无疑显示了它在恶性黑素瘤治疗中的潜在应用价值,但和厚朴酚作用于黑色素瘤细胞的分子机制仍有待深入探讨。 |