迷迭香提取物含有酚性二萜类鼠尾草酸及其衍生物鼠尾酚,由于高抗氧化活性,因此,越来越广泛的应用在产品之中,来延长保质期。我们在此描述了鼠尾草酸的完整生物合成途径及其在酵母细胞中的重组。迷迭香和鼠尾草中的细胞色素P450加氧酶(CYP76AH22-24)能产生11-羟基铁绿酚,通过鉴定该酶为铁绿酚合成酶。丹参的铁锈醇合酶(CYP76AH1)中,三种氨基酸基于模型的突变体可以将其转化为11-羟基铁锈醇合酶(HFS)。由相关的CYP76AK6-8催化,通过三次连续C20氧化,从而将11-羟基铁绿酚转化为鼠尾草酸。酚二萜类化合物具有强大的抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性,因此,鼠尾草酸生物合成基因的可利用性为酚二萜类化合物的代谢工程提供了机会。
杂志名:nature communications.2016,12942 . https://doi.org/10.1038/ncomms12942
英文题目:Elucidation of the biosynthesis of carnosicacid and its reconstitution in yeast
作者:Ulschan Scheler,Wolfgang Brandt, Andrea Porzel, Kathleen Rothe, David Manzano, DraganaBozˇic,Dimitra Papaefthimiou, Gerd Ulrich Balcke, Anja Henning, Swanhild Lohse,Sylvestre Marillonnet,Angelos K. Kanellis, Albert Ferrer& Alain Tissier
单位:细胞和代谢生物学系,莱布尼茨植物生物化学研究所,德国; 植物代谢和代谢工程项目,农业基因组学研究中心,西班牙
紫杉醇和青蒿素等三萜类药物已成为癌症和传染病治疗中不可或缺的药物。此外,从迷迭香(迷迭香属药用植物)和各种鼠尾草属植物(鼠尾草属植物)中提取的酚类labdane型二萜类化合物鼠尾草酸(CA)、鼠尾酚(CO)和豆酸(PA;图1)也属于萜类化合物的大家族。具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗微生物等特性。CA被认为是一系列二萜类化合物的前体,包括丹参中的丹参酮,它们的抗癌活性正被积极研究。生物合成的第一个关键步骤是由萜烯合酶 copalyl 二磷酸合酶 (CPS) 和miltiradiene 合酶 (MiS)催化的。CPS和MiS分别将香叶基香叶基二磷酸(GGPP)环化为棕榈酰二磷酸,棕榈酰二磷酸环化为miltiradiene(图1)。miltiradiene氧化为abietatriene是自发发生的,但暴露在紫外线照射下会加速。下游途径中的一个关键中间体是铁绿酚。对丹参、紫穗槐和药用植物中CYP76家族的几种细胞色素P450单加氧酶(CYP)进行了表征,它们能够将abietatriene转化为铁绿酚。这些酶统称为铁绿酚合成酶(FSs)。我们展示了先前从S. fruticosa和R. officinalis 中鉴定出的 FS进行两次连续的氧化,产生了下一个中间体 11-羟基铁杉醇,重新命名为 11-羟基铁杉醇合酶 (HFS)。利用HFS和FS之间的相似性,来自丹参的FS中的三个氨基酸残基与HFS中的相应残基反应可以将FS转化为HFS。
图1 迷迭香和鼠尾草中PDs的生物合成。
HFSs的鉴定。使用为酵母开发的金门模块化克隆载体系统,我们使用称为FSs的CYPs,即CYP76AH1、CYP76AH4、CYP76AH22、CYP76AH23或CYP76AH24,然后在酵母中重建铁绿酚生物合成。为了确保所有基因的有效共表达,我们开发了一个合成半乳糖诱导型启动子文库。正如预期的那样,获得的酵母菌株提取物在气相色谱-质谱(GC-MS)测量(图2a)中显示了miltiradiene、abietatriene和铁绿酚的存在。FS 和 HFS 的活性通过来自表达 CYP76AH1 和 CYP76AH22 酵母菌株的微粒体部分的体外实验得到证实。
图2 基于同源模型的FS和HFS突变。
为了分析 FS 和 HFS 之间的功能差异,我们对 CYP76AH1、CYP76AH4、CYP76AH22、CYP76AH23 和 CYP76AH24 进行同源建模。由于蛋白质之间的高度序列同一性(平均 80%)导致预测的三级结构几乎相同。通过三维模型比较,表明在HFS活性位点(E301、S303和F478)中鉴定出三种氨基酸,它们在FS(D301、N303和V479)中不同,可能与铁绿酚的氧化有关(图2c、d)。
在酵母中测定了单突变以及几种双、三和四突变组合与 CM 的体内共表达。HFS中第117和118 位的突变阻止了铁锈醇的氧化,但 FS 中的相互突变不支持铁锈醇的氧化,表明这些残基不是铁锈醇氧化所直接需要的。相比之下,双突变体 FS D301E、N303S可以产生羟基铁黄醇,但与 HFS 相比比例较小。此外,三重突变体 FS D301E、N303S、V479F具有与 HFS 无法区分的特征(图2e,f),这也通过体外测定得到证实。这三种氨基酸在铁锈醇氧化中的相关性通过对铁锈醇停靠在活性位点上的三维模型的分析得到证实(图2d)。总之,我们的结果表明,301、303和478处的氨基酸残基对HFS中铁绿酚的11-羟基化有重要贡献,值得注意的是,FS中残基的相互交换重新概括了HFS活性。
CYP76AK6-8 氧化C20产生 CA。CYP编码基因经常参与萜烯的氧化。为了确定CA途径中缺失的步骤,我们搜索了与上游步骤表达模式相似的基因,即CPS和MiS,它们优先在幼叶的毛状体中表达。利用RNA(包括分离的毛状体和无毛状体的叶片,以及来自药用植物和紫穗槐的幼叶和老叶)对从药用植物和紫穗槐的RNA测序数据中确定的候选基因进行实时PCR分析。编码高度相似蛋白质的R.officinalis(RoCYP76AK7和RoCYP76AK8)和S.fruticosa(SfCYP76AK6)的CYP基因在幼叶中的转录水平高于老叶,并在毛状体中特异表达(图3a)。有趣的是,这些CYPs与FS和HFSs具有高度的序列相似性。
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图 3:C 20 Ox的功能分析。(a)CYP76AK6-8在幼龄和老年毛状体及无毛状体叶片中的表达谱。( b )来自迷迭香叶表面或共表达 GGPPS、CPS、MS、ATR1、CYP76AH22 (HFS) 的酵母菌株的提取物的GC-MS 分析。(c)来自酵母或迷迭香的 PD 的电子冲击质谱。( d ) LC-MS 分析。( e ) 来自酵母的 PD 的 ESI 质谱图
由于CA途径中氧化的确切顺序尚不清楚,我们首先通过在烟草中瞬时与CPS和MiS共表达来检测CYPs。通过GC-MS分析,在CPS、MiS、ATR1和CYP76AK7的叶片表面提取物中含有分子量为286和257的基峰,表明存在带有醛基的二萜(图3b、c)。GGPPS、CPS、MiS、ATR1和CYP76AK6、CYP76AK7或CYP76AK8在酵母中的共同表达产生了相同的化合物。纯化和NMR分析后,该产物被鉴定为miltiradien-20-al。首次证明CYP76AK6、CYP76AK7和CYP76AK8可在C20位置氧化miltiradiene,因此被命名为C20Ox(图4)。
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图 4:工程 CA 途径概述。
为了研究 C 20 Ox 除了 11-羟基铁杉醇和miltiradiene之外,是否还可以氧化铁杉醇。因此,将新鉴定的酶与 CPS、MS 和 FS (CYP76AH1) 共表达。GC-MS分析和与已发表数据的对比分析表明,少量的pisiferal的存在,表明铁绿酚确实也是C20Ox的底物(图3b、c)。
结论:
总之,在生物合成中,CA缺失基因的发现使酵母工程化成为可能。即使与复杂的化学合成相比,它也证明了酶促合成高价值产品的能力。用于酵母中 CA 生物合成的组合方法构成了一个通用且有效的平台,可以用来阐明和生产其他相关萜类化合物。
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