六味地黄汤相关单体对HepG2细胞内PPARδ水平的影响

发布时间:2012-12-13 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2655

PPAR3(peroxi—some proliferator activated re— ceptor)是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的 3个亚型之一。在胰岛、心肌、骨骼肌、脂肪组织、皮肤、脑组织中均有较高表达。近年来的研究表明，其在肌肉、脂肪等组织的脂肪酸氧化过程中，不但发挥着重要的调控作用，而且与胰岛素的敏感性有关，如 PPAR8激动剂喂养的肥胖鼠可以减少脂肪沉积并改善胰岛素的敏感性[1 ]。六味地黄汤的现代药理研究表明，其具有调节糖代谢、调节免疫功能、对抗多种损伤、稳定细胞膜等多种作用，且能增加肝糖原含量，降低肝葡萄糖一6一磷酸酶活性[3]，降低糖尿病动物的血糖、血脂、游离脂肪酸[4]，还具有抗氧化、清除自由基[5 等作用。而关于六味地黄汤单体成分对PPAR作用的研究至今尚未见报道。笔者通过建立HepG2(人肝癌细胞)细胞高脂模型，降低PPAR 的水平，再给予六味地黄汤相关单体成分芍药苷、没食子酸、丹皮酚、梓醇、钱苷、莫诺苷、桃叶珊瑚苷、23一乙酰泽泻内酯醇B、薯蓣皂苷元，考察各单体对PPAR 的作用。

1 仪器与材料

1．1 仪器超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司)；IX71倒置荧光相差显微镜(日本Olympus公司)；BB16型二氧化碳培养箱(德国Hearous公司)； HH_4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；1K15 高速离心机(美国Sigma公司)；XW-80A 旋涡混合器 (上海医科大学仪器厂)；NOVAPHTHTM 酶标仪(美国Bio-Rad公司)；Luminoskan Acsent型微孔板测读仪 (美国Thermo Scientific公司)；BS210S电子天平(德国Sartorius公司)；Forma一86℃超低温冰箱(美国 Thermo公司)；-20℃冰箱(青岛海尔公司)。

1．2 细胞 HepG2(美国ATCC)。

1．3 药物与试剂芍药苷、没食子酸、丹皮酚、梓醇、马钱苷、莫诺苷、桃叶珊瑚苷、23-乙酰泽泻内酯醇B、薯蓣皂苷元(质量分数98 9／6，均用DMSO 配成10 mol·L一，微孔滤膜过滤，再用培养基配成1O_。， 10 和10 mol·L )，由中国药科大学天然药化教研室提供；DMEM(高糖)培养基、胎牛血清(FetBovine Serum，FBS)购自美国GIBCO公司；青霉素、链霉素、胰蛋白酶、EDTA、二甲基亚砜(DMSO)、碳酸氢钠、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均为分析纯，购自南京化学试剂一厂；脂肪乳注射液；PPA EUSA试剂盒(武汉优尔生物技术有限公司)。

2 实验方法

2．1 细胞培养人肝癌细胞HepG2培养在含1O 胎牛血清的培养基中、100 U·n 青霉素、IO0 -n讧『链霉素的DMEM(高糖)培养基(pH7．2～7．4)中，置 37℃、体积分数5 CO：培养箱中培养。细胞呈贴壁生长，每1～2 d换液1次。3～4 d细胞融合时传代，弃去培养瓶中培养基，PBS冲洗1～2遍，2．5 g·L 胰酶消化至部分细胞卷缩，加少许含1O 胎牛血清的培养基终止消化，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液，离心，将细胞重悬于含1O 胎牛血清的培养基中，以1×1O 个细胞·mL 接种入新培养瓶，继续培养与传代。实验选取处于对数生长期的细胞。

2．2 细胞高脂模型的建立及给药[6-7] HepG2生长到80 后，用2．5 g·L 胰酶消化，离心，重悬形成细胞悬液；将细胞吹散均匀接种到6孔板，细胞浓度 1×10 个·mL～，每孔2 mL；细胞培养24 h贴壁后，弃上清，将细胞分为高脂模型组，高脂模型+待筛药物组；其中所有模型组加入200肛L脂肪乳注射液，给药组的药物量为200 L，药物浓度见表1所示；剩下的体积用含血清的DMEM 补齐至2 mL；给药24 h后，用PBS洗5遍，以去掉未吸收的脂肪乳，每次2 rain，之后加200肚L细胞裂解液，置于冰上片刻后，用细胞刮刀刮下细胞及碎片，转移裂解液及碎片入 1．5 mL的doff管中，4℃ ，12 000 r·min 离心10 min，取上清，BCA定蛋白，做ELISA时用。

2．3 ELISA 法测定各组RRAP 的质量浓度按照 PPAR6 ELISA 试剂盒，9种单体成分各3个浓度 (10～，10 和10 tool·L )加到hepG2高脂模型中，按步骤进行检测。

2．4 统计学处理实验结果用z土S表示，用SPSS 11．5统计软件包进行方差分析。

3 实验结果

3．1 量效曲线按照ELISA 法项下操作，以A 值的对数为横坐标，以质量浓度的对数为纵坐标回归，得标准曲线：Y一2．052 2X+4．031 6(r一0．992 8)。

3．2 各单体对PPAR8水平的影响丹皮酚、薯蓣皂苷元、桃叶珊瑚苷3个单体在不同质量浓度下使 PPAR 都有明显的增加，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0．01)，其他PPAR8水平。见表1。

4 讨论

PPAR激动剂作为一类2型糖尿病治疗药物开发，其可影响心血管危险因子。PPAR双通道激动剂可降糖、降脂及预防心血管并发症的发生发展，减少胰岛细胞内的三酰甘油沉积，降低胰岛素分泌，可能防止长期高脂条件下的胰岛细胞功能耗竭。姜友昭等发现PPAR3能够促进胰岛细胞的脂肪酸氧化，增强胰岛细胞的脂肪酸氧化相关基因的表达，促进脂肪酸氧化利用、减少胰岛口细胞内的三酰甘油沉积，从而减轻胰岛I9细胞的脂毒性。啮齿类动物骨骼肌中PPAR3活性表达可增加工型／Ⅱ型肌纤维比例，使肌纤维中参与脂肪酸氧化、线粒体内氧化呼吸和肌纤维慢收缩等物质的相关基因表达增强[9]，工型肌纤维比例增加，可增强机体运动耐力，促进骨骼肌脂肪酸氧化，避免过多的脂肪沉积在脂肪细胞而增加体质量，对预防肥胖和改善胰岛素抵抗有重要的意义。

有关六味地黄汤全方降糖、降脂研究颇多，相关单体降脂作用研究较少。研究表明，在兔、大鼠等多种实验性AS动物模型中，丹皮酚均能降低模型动物血清中总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平_1 ，具有改善血液流变学、降低脂质、抑制脂质过氧化等作用口。马海英等口删实验证明，给大鼠灌胃薯蓣皂苷元和黄山药总皂苷，均能明显降低血中胆固醇含量，而薯蓣皂苷元的绝对剂量仅为黄山药总皂苷的1／2，说明薯蓣皂苷元抗高胆固醇血症的作用优于黄山药总皂苷，薯蓣皂苷元预防和治疗高胆固醇血症的作用机制为：薯蓣皂苷元的极性和空间结构与胆固醇极为相似，因此在肠道中可以同胆固醇一样在胆汁酸作用下分散成薯蓣皂苷元咬粒直接被肠黏膜吸收。当薯蓣皂苷元与胆固醇同时存在时，薯蓣皂苷元竞争性与胆汁酸作用从而抑制胆固醇的吸收。临床证明，薯蓣皂苷元(维奥欣)具有调节脂质代谢、改善血液流变学作用，明显降低血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白和氧化修饰低密度脂蛋白含量，降低高、低切变率下的全血黏度以及血浆黏度，因此可减轻动脉壁脂质浸润及斑块形成，从而防治动脉粥样硬化。桃叶珊瑚苷治疗后，糖尿病大鼠的一般状态和体质量在一定程度上恢复，血糖值和脂质过氧化程度较未治疗的糖尿病大鼠明显降低，抗氧化酶的活性有所提高，机体抗氧化能力得到回升[】。HepG2细胞是人肝癌细胞株，来源于肝脏又基本保留了正常肝细胞的基本生物特性，其表面表达高亲和力的胰岛素受体，满足典型胰岛素受体所要求的标准[1引，包括葡萄糖摄取、糖原合成酶的活性、脂类生成及RNA的合成，是研究肝胰岛素抵抗的理想细胞模型_l 。本实验通过所建立的HepG2细胞高脂模型研究六味地黄汤相关单体成分对PPAR 水平的影响，结果发现丹皮酚、薯蓣皂苷元、桃叶珊瑚苷能明显地增加 PPAR 的水平。另外，有文献报道，没食子酸对 PPART有很好的激动作用，但对PPAR 激动作用不明显L1 ，本实验中也未见明显作用；对于其余单体，尚未见有降糖、降脂的研究，在本实验中，它们对 PPAR8的激动作用也不明显。