摘 要：目的 探究杜仲不同提取物对帕金森病小鼠的治疗作用及其超高效液相色谱（UPLC）分析与治疗帕金森病的谱效关系。方法 通过小鼠爬杆实验、脑内纹状体多巴胺（DA）含量，观察杜仲不同梯度的乙醇提取物对帕金森病小鼠的治疗作用；采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）对杜仲不同提取物进行分析；结合爬杆实验及DA水平结果，采用偏最小二乘法回归（PLSR）分析建立其谱效关系，明确杜仲治疗帕金森病的药效成分。结果 杜仲50%、75%乙醇提取物均能明显缩短小鼠爬杆时间；杜仲75%乙醇提取物能显著增加小鼠脑内纹状体DA水平；PLSR分析结果显示，杜仲中杜仲醇苷、鹅掌楸苷、5-羟甲基糠醛、咖啡酸与爬杆实验结果和纹状体多巴胺含量密切相关。结论 杜仲乙醇提取物具有抗帕金森病作用，其中75%乙醇提取物效果最显著；杜仲醇苷、鹅掌楸苷、5-羟甲基糠醛、咖啡酸可能是杜仲治疗帕金森病的主要有效成分。

杜仲为杜仲科（Eucommiaceae）杜仲属Eucommia Oliver植物杜仲E. ulmoides Oliv. 的干燥树皮，是我国名贵的滋补药材。杜仲性温，味甘，归肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、安胎的功效^[1]。现代研究发现，杜仲主要成分为木脂素类、多糖类、环烯醚萜类、黄酮类、氨基酸类等，其主要有增强免疫力、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗肝纤维化、抗炎等药理作用^[2]。帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的渐进性神经系统退行性疾病，发病机制主要为多巴胺（DA）能神经元退行性死亡，临床表现主要为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态不稳等运动症状及情绪障碍、睡眠障碍、感觉障碍、自主神经功能障碍等非运动症状^[3-4]。

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）是建立PD模型的常用药物，能够直接损伤小鼠脑内多巴胺能神经元，减少多巴胺的产生，导致小鼠出现PD症状^[5]。爬杆实验是常用的衡量PD动物模型运动状况的行为学指标^[6-7]。近年来，中药谱效关系在药效物质基础方面的研究应用越来越广泛^[8]，而杜仲改善PD症状的药效物质基础研究较少。本实验采用不同梯度的杜仲乙醇提取物ig给予MPTP诱导的PD小鼠，检测其行为学指标爬杆时间和脑内纹状体DA水平，以考察杜仲对PD的治疗作用。同时采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术对杜仲不同提取物进行分析，并将分析结果与爬杆时间和DA含量相结合，分别进行偏最小二乘回归法（PLSR）分析，阐述UPLC特征峰与抗PD作用的相关性，综合分析2组谱效关系得出的结果，找出与治疗PD密切相关的有效成分，为深入研究杜仲治疗PD作用及阐明其药效物质基础提供依据。

1 材料

1.1 药物及试剂

杜仲药材购于河北省安国药材批发市场，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为杜仲科杜仲属植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv. 的干燥树皮。

无水乙醇购自天津市康科德科技有限公司； MPTP（批号SLBS6630，质量分数≥98%）、盐酸DA（批号606A023，质量分数≥98%）均购自美国Sigma公司；熊果酸（批号1213A025，质量分数≥98%）、京尼平（批号117B021，质量分数≥98%）购自北京索莱宝科技公司。高氯酸（批号201201）购自天津市鑫源化工有限公司。

1.2 动物

清洁级雄性C57BL/6J小鼠，60只，体质量19～23 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格证号SCXK（京）2014-0004。

1.3 仪器

高效液相色谱系统（Agilent公司，美国）；电化学检测器（Antec Leyden公司，荷兰）；Waters反相C₁₈色谱柱、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、超高效液相色谱-质谱联用仪（Waters公司，美国）；万分之一天平（上海赞维衡器有限公司）。

2 方法

2.1 杜仲提取物的制备

分别称取50 g杜仲至1 L圆底烧瓶中，分别加入10倍量即500 mL纯水及25%、50%、75%、95%乙醇，回流提取2 h，抽滤，将药渣按同样方法加入8倍量溶剂，回流提取2 h，抽滤，2次提取的药液合并旋蒸至50 mL，即制成含生药1 g/mL的药液。

2.2 PD模型的制备、分组及给药

将60只小鼠按体质量随机分为对照组、模型组、杜仲纯水提取物组（纯水组）及杜仲25%、50%、75%、95%乙醇提取物组（25%、50%、75%、95%乙醇组）。小鼠适应性饲养3 d，自由饮食饮水。对照组、模型组小鼠ig给予蒸馏水（0.01mL/g），纯水组及25%、50%、75%、95%乙醇组分别ig给予相应的药液（0.01 mL/g），连续给药3d。第4天开始，模型组、纯水组和25%、50%、75%、95%乙醇组小鼠每天给药1 h后ip给予MPTP（30 mg/kg），3～5 min后小鼠出现震颤、站立行走不稳、毛发竖立等症状。对照组小鼠ip等剂量生理盐水，连续5 d。

2.3 爬杆实验

取1根长约60 cm，直径约1 cm的竖杆，顶端固定直径约2.5 cm的塑料小球，竖杆缠上纱布以防打滑。将小鼠头部朝下置于顶端球上。记录其开始向下爬行到双后肢落地的时间，如小鼠中途停顿或反向爬行，则重新测量，超过60 s则记为60s。正式实验前3 d每天进行训练使小鼠适应爬杆行为。末次给药1 h后为正式实验，重复3次，每次间隔5min。

2.4 小鼠脑内纹状体DA含量测定^[9]

2.4.1 样品制备 爬杆实验结束后，将小鼠快速断头取脑，冰上剥离纹状体，称质量，每毫克组织加10 μL 0.1 mol/L高氯酸溶液，匀浆，4 ℃、14 000 r/min离心20 min，取上清，置于冰上备用。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品DA 10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加高氯酸定容至刻度，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液备用。

2.4.3 HPLC色谱条件 色谱柱：Waters反相C₁₈色谱柱（150 mm×4.5 mm，5 μm）；流动相为19%甲醇-3%乙腈-78%水（含辛烷基11.56 mmol/L、NaH₂PO₄ 100 mol/L、EDTA-2Na 0.095 mmol/L），pH 3.3～3.4；体积流量1 mL/min；柱压1.35×10⁴ kPa；进样体积10 μL。

2.5 杜仲不同提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析

2.5.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC HSS T3 C₁₈色谱柱（100 mm×2.1mm，1.8 μm），流动相为0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱程序见表1。柱温40 ℃；体积流量0.3 mL/min；样品室温度4 ℃；进样体积5μL，进样时间33 min。

2.5.2 质谱条件 运用四极杆飞行时间串联质谱仪进行分析与鉴定。采用正、负离子模式，电喷雾离子源（ESI源）。毛细管电压1.0 kV，脱溶剂温度300 ℃，离子源温度120 ℃，脱溶剂气体积流量800 L/h，锥孔气体积流量50 L/h。相对分子质量扫描范围m/z50～1 200，数据采集采用MSE模式。

2.5.3 对照品溶液的制备 精密称取对照品熊果酸、京尼平各1 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22 μm微孔滤膜，取滤液备用。

2.5.4 供试品溶液的制备 分别称取杜仲5种不同提取液，用50%乙醇配制成质量浓度为生药20mg/mL的供试品溶液，超声（功率100 W，频率40 kHz）30min后过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，备用。

2.6 统计学分析

数据用表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），采用SPSS 17.0软件进行分析。

3 结果

3.1 杜仲不同提取物对PD小鼠爬杆时间的影响

给药结束后，模型组小鼠精神萎靡，行动迟缓，步态不稳。与对照组比较，模型组小鼠爬杆时间显著延长（P＜0.01）。与模型组比较，其他各给药组小鼠爬杆时间缩短，其中，50%及75%乙醇组小鼠爬杆时间差异显著（P＜0.05、0.01），见图1。

3.2 杜仲不同提取物对PD小鼠脑纹状体DA水平的影响

采用HPLC-ECD法检测PD小鼠脑纹状体组织DA水平。如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠纹状体组织中DA量明显降低（P＜0.01）；给予杜仲提取物后，75%乙醇组小鼠纹状体组织中DA水平显著升高（P＜0.05）。

3.3 杜仲不同提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析

采用正、负离子模式采集杜仲不同提取物的质谱信息。通过MassLynx 4.1工作站得到杜仲5种提取物的正、负离子模式UPLC叠加图（图3）。与对照品比对并结合文献信息^[10-20]，对UPLC分离出的50个主要特征峰进行分析，鉴定出26个成分（表2）。

3.4 杜仲提取物UPLC图谱与抗PD作用的PLSR分析

采用SIMCA-P 12.0数据处理软件，将UPLC检测出的50个化合物的相对含量（X）分别与爬杆时间（Y₁）、DA水平（Y₂）2个药效指标进行PLSR分析，经处理计算得到各变量标准化的回归系数和变量重要性投影（VIP）值。

3.4.1 杜仲提取物UPLC-Q-TOF/MS分析结果与爬杆时间的相关性 杜仲提取物化合物分析结果与爬杆时间的PLSR回归系数及VIP贡献值见图4。分析结果显示杜仲提取物中的色谱峰有23个与爬杆时间呈正相关，其余27个峰与其呈负相关。一般而言，VIP值＞1，说明其对模型有显著贡献，对爬杆时间进行PLSR分析，结果显示峰26、48、45、44、13、5、31、10、4、19、23、22、35、36、9、49、47、30、3的VIP值＞1，说明在杜仲提取物的UPLC分析结果中，相对应的成分对药效指标爬杆时间发挥着重要影响。

3.4.2 杜仲提取物UPLC-Q-TOF/MS分析结果与DA水平的相关性 杜仲提取物化合物分析结果与DA水平的PLSR回归系数及VIP贡献值见图5。杜仲提取物中的色谱峰中有21个与DA水平呈正相关，其余29个峰与其呈负相关。同时对纹状体DA水平也进行PLSR分析，结果显示峰45、44、48、22、7、26、24、41、33、5、29、31、23的VIP值＞1，说明在杜仲提取物的UPLC指纹图谱中，相对应的成分对药效指标纹状体DA水平发挥着重要影响。

结合2个药效指标的PLSR分析结果，发现45、44、48、22、26、5、31、23号峰对爬杆时间和DA水平均发挥着重要的影响，其中5、22、23、26号峰经鉴定分别为杜仲醇苷、鹅掌楸苷、5-羟甲基糠醛、咖啡酸。

4 讨论

近年来，越来越多的研究表明杜仲及其化学成分具有神经保护作用，不少治疗中枢神经系统疾病的临床成方或经方中均含有杜仲^[21]，一些治疗PD的方剂中也多以杜仲入药^[22-24]。但目前杜仲对于PD的治疗还仅停留在临床阶段，少见实验依据。本研究观察了杜仲提取物对PD小鼠的治疗作用。运动功能障碍是PD患者的主要临床表现，爬杆实验主要考察PD小鼠的肢体运动协调能力，可以作为金指标反映药物对PD的治疗作用。PD主要病理改变是黑质致密部DA神经元严重缺失，纹状体DA水平下降，导致肌肉运动障碍、运动震颤麻痹等，因此调节脑内纹状体DA水平亦是治疗PD的关键。小鼠ip MPTP后出现静止性震颤、运动协调能力下降、运动减少等PD症状，ig给予杜仲提取物后，其行为活动状态有所改善。与模型组小鼠比较，杜仲给药组小鼠爬杆时间、纹状体DA水平亦明显改善，证实杜仲对PD有治疗作用。

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS法分析并鉴定出杜仲不同提取物中26种化合物。分别将行为学指标爬杆时间、纹状体DA水平与所得到的特征峰进行PLSR分析，评价各成分对药效作用的贡献，再将对爬杆时间和DA水平起较大贡献的2组成分进行合并分析，发现杜仲醇苷、鹅掌楸苷、5-羟甲基糠醛、咖啡酸等成分既能改善PD小鼠运动障碍，又能升高其纹状体DA水平，可能是杜仲治疗PD的药效成分。

PD患者及动物模型体内存在氧化应激和神经损伤，并伴随着炎症的产生^[25-26]。据文献报道^[27]，鹅掌楸苷具有抗炎镇痛作用；5-羟甲基糠醛具有抗氧化、脑神经保护的作用，且能减轻纹状体神经元损伤^[28-29]；咖啡酸具有抗氧化、抗炎及抑菌作用^[30]，这与本实验结果一致。下一步将继续对这几种成分进行药效验证，为深入研究杜仲治疗PD的药效物质基础提供依据。

参考文献（略）

来  源：李莉莉，马宁宁，范姗姗，马  静，杨昌硕，郭  虹，宋丽丽，庄朋伟. 杜仲不同提取物对帕金森病小鼠的治疗作用及谱效关系研究 [J]. 中草药, 2019, 50(6):1400-1407.

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