远明1,刘颖菊2*,王梦华2,高丽佳2 (1遂宁市中心医院,四川遂宁629000;2重庆医科大学药理教研室,重庆400016)
摘要:目的:通过建立高脂血症脂肪肝动物模型,探讨杜仲叶醇提取物(alcohol extractive of Folium Eucommiae,AEFE)对脂肪肝的防治作用。方法:高脂饮食8周加维生素D36×105IU/kg分3d腹腔注射,建立大鼠高脂血症脂肪肝动物模型。各给药组从造模第3周开始分别灌胃给予洛伐他汀(4mg·kg-1·d-1)、 AEFE(70、140和420mg·kg-1·d-1),共给药6周。各组每天灌服等量生理盐水,灌胃容积为0.5mL/100g体重。结果:AEFE用药6周后显示,各剂量组血清胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸、谷丙转氨酶和谷草转氨酶均较模型组明显降低(P<005),肝组织丙二醛含量降低和超氧化物歧化酶活性升高,肝脂肪变性和炎症反应减轻,尤以中剂量组作用最明显(P<001)。AEFE对肝内肿瘤坏死因子α浓度无明显影响。结论:AEFE改善高脂性大鼠肝脏脂肪变性,此作用可能与其降血脂、抗氧化损伤有关。
关键词:杜仲叶;脂肪肝;氧化应激;肿瘤坏死因子 杜仲叶提取物 杜仲提取物 杜仲绿原酸 长沙上禾生物杜仲提取物
近年来,随着人们生活水平的提高,由饮食导致的脂肪肝发病率逐渐增高,除控制饮食、增强体育锻炼外,有效的药物治疗也是必要的,但目前仍缺乏理想的药物。中医中药是我国巨大的医药宝库,在综合降脂保肝治疗中具有明显的优势。为寻找有效的治疗药物,本实验通过建立大鼠脂肪肝模型,以洛伐他汀为阳性对照药,观察杜仲叶醇提取物(alcohol extractive of Folium Eucommiae,AEFE)对高脂性脂肪肝的保护作用及机制。 1材料与方法 11材料 111动物:雄性Sprague Dawley大鼠,体重200~250g,由重庆医科大学实验动物中心提供(医学动物合格证:SCXK渝20020003)。
112药品与试剂AEFE:根据文献[1]制备并浓缩至100%(相当于1mL含生药1g)备用,由重庆医科大学化学教研室提供并鉴定。洛伐他汀:由重庆大新药业股〖KG(0.20mm〗份有限公司提供,批号040501。丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)试剂盒:解放军总医院科技开发中心放射免疫所。其余试剂均为国产分析纯。
表1AEFE对大鼠血清脂质水平及转氨酶的影响(±s,n=8)
表2AEFE对大鼠肝脂肪变性和炎症活动度的影响
113实验仪器:MoDular p800型全自动生化分析仪:瑞士罗氏公司;722型可见光分光光度计:上海菁华科技仪器有限公司。SN695B型放射免疫测定仪:上海核辐光电仪器设备有限公司。
12方法 121实验分组:实验动物随机分为6组,每组8只:正常组,模型组,阳性药物组,高、中、低剂量AEFE治疗组。饲养于二级动物房,自由饮水。 122模型复制:参考文献[2]方法建立大鼠高脂血症脂肪肝模型:于实验开始时给予模型组及各给药组大鼠腹腔注射Vit D3注射液(总剂量6×105IU/kg,分3d给完),同时开始给予模型组及各给药组大鼠高脂饲料(配方:3%胆固醇,05%猪胆盐,02%丙硫氧嘧啶,5%白糖,10%猪油,813%基础饲料),共8周。正常组饲普通基础饲料。各给药组从造模第3周开始灌胃给药,阳性药物组给洛伐他汀(4mg·kg-1·d-1),AEFE治疗组分别给AEFE 70、140和420mg·kg-1·d-1,共给药6周。正常组与模型组每天灌服等量生理盐水,灌胃容积为05mL/100g体重。
123标本采集及测定:给药6周后最后一晚禁食,不禁水。次日将各组大鼠麻醉后心脏采血,分离血清,全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(total cholesterols,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST);取肝右叶制备10%肝匀浆,3000r/min,离心10min后取上清液比色法测定肝组织MDA含量和SOD活力,放免法测定肝内TNFα浓度;同时取肝脏左叶10%甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色,在光学显微镜下观察肝脂肪变性程度和炎症活动度[3]。
药物治疗肝脂肪变性疗效判定分为治愈率和有效率。治愈率是指肝脏脂肪变程度为“-”所占的比率,有效率是指肝脏脂肪变程度为“-”~“+”所占的比率。
124统计学方法:所有结果均以±s表示,数据采用SPSS130统计软件分析处理,两组比较用t检验,多组比较用单因素方差分析,等级资料采用秩和检验。 2结果 21AEFE对血脂及转氨酶的影响:模型组大鼠血清TC、TG、FFA、ALT和AST较正常组均明显升高(P<001);AEFE各剂量组及阳性药物组以上指标与模型组相比均降低,差别具有显著性(P<001)(表1)。 22AEFE对肝脏病理变化的影响: AEFE各剂量组和阳性药物组的肝脂肪变性程度和炎症活动度较模型组减轻,以AEFE中剂量组最明显,治疗肝脂肪变性的有效率达625%,但各组治愈率均为0(表2)。 23AEFE对肝匀浆MDA、SOD和TNFα的影响:与正常组相比,模型组肝脏中MDA和TNFα明显升高,SOD活性明显降低(P<001)。各用药组MDA浓度较模型组明显降低,SOD活性明显高于模型组(P<005),以AEFE中剂量组最显著,但各用药组与模型组相比TNFα虽有下降趋势,统计学上无差异(表3)。
3讨论 近年来认为高脂饮食引起过多脂肪摄入,脂肪在肝内外过多贮积,引起胰岛素抵抗和血浆游离脂肪酸增加,致使肝内反应氧、自由基生成增多,促发肝细胞凋亡、坏死,继之引起肝内脂质过氧化进一步增强,形成恶性循环,加速脂肪肝炎的形成,这是高脂饮食致脂肪肝的主要发病机制[4]。在此过程中TNFα参与了脂肪肝的发生、发展[5]:高浓度的TNFα可促进外周组织脂肪动员,使血中游离脂肪酸增加,肝细胞TG的合成及聚集增加;当血中及肝内的游离脂肪酸增多时,游离脂肪酸又可使TNFα表达增加,并加强TNFα等细胞因子的毒性,引起线粒体功能不全、肝细胞损伤。
表3AEFE对大鼠肝匀浆MDA、SOD和TNFα的影响
本实验采用高脂、高胆固醇饲料加Vit D3的混合方式造模8周,结果显示模型组大鼠肝脏脂肪变性程度和炎症活动度计分增高,同时血清TC、TG、FFA、转氨酶明显升高,肝脏MDA和TNFα含量增加,SOD活性明显降低。此结果说明该方法能在短时间内成功造模,且该模型与人类肥胖、高脂血症相关性脂肪肝的表现极为相似,也进一步证实脂肪肝的发生与脂质过氧化、FFA和TNFα增高有关。 杜仲是我国特有的滋补中药材,其味甘、性温,久服能轻身耐老、延年益寿,具有提高机体抗缺氧耐力、改善机体免疫功能、降低血脂、平衡调节血压等功效[6]。杜仲传统以皮入药,但树皮生长周期很长,难以满足人们的需求。近年的研究证明,杜仲叶与杜仲皮的有效成分基本相同[7],AEFE同样具有降低血脂、保护血管内皮细胞、抗动脉粥样硬化等功效[8,9]。本研究结果显示AEFE在降低血清TC、TG的同时,FFA、ALT、AST明显降低,肝脏脂肪变性和炎症反应明显减轻,说明AEFE对高脂性脂肪肝有治疗作用。同时AEFE也使肝MDA减少,SOD活性增强,提示AEFE可通过改善脂质代谢,减少FFA的生成,抑制脂质过氧化来发挥对肝细胞的保护作用。实验结果也显示AFFE中剂量组(140mg·kg-1·d-1)效果最好,这提示中剂量已达最大效应。另外,AEFE各剂量对肝脏中TNFα含量无明显影响,这可能与用药的疗程和开始给药的时间有关,需要进行进一步的研究;AEFE只能减轻肝脂肪变性但不能完全逆转肝脏的脂肪变性,所以有效率可达625%,而治愈率为零。 综上所述,AEFE具有良好的降血脂、改善脂质过氧化、减轻肝脂肪变性的作用,有希望开发为单用或与其它药物组方的、有效的治疗脂肪肝药物。
4参考文献
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