厚朴酚固体分散体的制备及生物利用度研究 | 厚朴酚固体分散体的制备及生物利用度研究 |
| 发布时间:2022-03-06 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:461 |
| 目的 采用热熔挤出技术制备厚朴酚固体分散体，提高厚朴酚体外溶出度及大鼠体内生物利用度。方法 通过溶解度参数筛选与厚朴酚相容性较好的4种载体共聚维酮S-630（PS-630）、羟丙基纤维素（HPC）、丙烯酸树脂Eudragit EPO（EPO）和聚乙烯已内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus）用于制备不同载药量的固体分散体。以体外溶出度为指标，应用差示扫描量热分析（DSC）、X-射线衍射分析（XRPD）和红外光谱（IR）表征所制备的固体分散体；采用UPLC-MS/MS评价大鼠口服厚朴酚固体分散体后体内药动学行为。结果 体外溶出度实验表明厚朴酚与PS-630、HPC和EPO这3种载体（质量比1∶6）分别制备的固体分散体均能显著提高厚朴酚的溶出度，且药物都是以无定形分散在载体中。体内生物利用度实验显示，PS-630和HPC制得的固体分散体中厚朴酚的血药峰浓度（Cmax）分别约为单体的5倍和2.3倍，药时曲线下面积（AUC0~t）分别提高了37.22%和70.88%，而EPO体系则未见生物利用度的提升。结论 热熔挤出技术可应用于提高难溶性药物厚朴酚的体外溶出度和体内生物利用度。 厚朴酚（magnolol，Mag）是木兰科植物厚朴的药效成分之一，属木脂素类化合物，具有抗炎、抑菌、抗氧化[1-2]等作用。最新研究发现Mag在抑制肿瘤生长、保护心血管、保护神经系统、抗脂肪肝形成、降血糖、抗腹泻等方面也拥有独特的疗 效[3-11]。但是Mag水溶性差，体内溶出度小，导致其生物利用度不高，从而限制了其临床应用[12]。为了解决这个问题，有研究者采用溶剂蒸发法分别制备了Mag固体分散体和磷脂复合物[13-14]；还有研究者通过乙醇注入法制备成Mag脂质体[15]，上述研究均提高了Mag的溶出度，但都存在一些问题，如溶剂残留、重复性差、工业化生产难等。 热熔挤出技术（HME）起源于塑料和高分子加工行业，近些年来因其操作过程中无需使用有机溶剂、药物分散效果好、适合于工业化生产等[16-19]优势而被广泛地应用到药物固体分散体的制备领域。最新研究还发现，相较于其他传统的固体分散体制备方法，HME法制备的固体分散体表现出更优秀的稳定性[20]。本实验采用HME制备Mag固体分散体，以溶出度为指标初步筛选载体和载药量，并评价所得固体分散体的物理化学状态。最后通过体内生物利用度实验评价热熔挤出技术对难溶性药物Mag生物利用度的提升作用。 1 仪器与材料 Process11热熔挤出机，美国赛默飞世尔科技公司；200 F3型差示扫描量热仪，德国耐士科技有限公司；D/max 2500/PC阳极转靶X射线衍射仪，日本理学公司；MPA傅里叶变换近红外光谱仪，布鲁克光谱仪器有限公司；ZRS-8GD智能溶出试验仪，天津市天大天发科技有限公司；Waters2695高效液相色谱仪、Waters Acquity UPLC TQD超高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪系统，美国沃特世科技有限公司；XP-6型百万分之一天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q Synthesis 108超纯水仪，美国密理博公司；Vortex genie涡旋仪，美国Scientific Industries公司；TGL-16C高速离心机，上海安亭科学仪器厂；KQ-500DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。 Mag原料药，批号20140513，质量分数98%，西安天本生物科技有限公司；Mag对照品，批号110729-200412，质量分数98.8%，中国食品药品检定研究院；山柰酚（kaempferol，Kae）对照品，批号K107144，质量分数≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；共聚维酮S-630（PS-630）、羟丙基纤维素（HPC），美国亚什兰公司；丙烯酸树脂Eudragit EPO（EPO），德国德固赛公司；聚乙烯已内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus），德国巴斯夫公司；乳糖、葡萄糖，上海卡乐康公司；甲醇，国药集团化药试剂有限公司；乙腈，质谱纯，美国默克公司；聚山梨酯80，南京化学试剂股份有限公司；重蒸水，自制。 SPF级SD大鼠24只，雄性，体质量200～220 g，浙江省实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（沪）2014-0001。 2 方法与结果 2.1 处方前研究 溶解度参数（δ）是判断体系相容性的常用指标之一[21]。Mag的δ通过基团贡献法使用Molecular Modeling Pro分子模型预测软件计算，载体的δ主要由文献得到[22]。研究表明，当2种化合物的溶解度参数差（Δδ）＜7 MPa1/2时，Mag和载体显示出良好的相容性，而当Δδ＞10 MPa1/2时，2种物质很可能不会相容[23]。Mag和各载体Δδ结果见表1，PS-630、HPC、EPO和Soluplus的Δδ＜7 MPa1/2，表明这些载体与药物有较好的相容性；而乳糖、葡萄糖的Δδ＞10 MPa1/2则显示它们很可能与药物不会相容而成为两相。因此，初步选择了PS-630、HPC、EPO和Soluplus这4种载体，每种载体分别制备高、中、低3种载药量的固体分散体（Mag/载体质量比分别为1∶3、1∶6、1∶9）。 图片 2.2 热熔挤出制备Mag固体分散体 Mag的熔点为105.5 ℃，PS-630、HPC、EPO和Soluplus的熔点经DSC测定均低于105.5 ℃。为了获得一种半固体、透明的便于下游操作的挤出物，热熔挤出机融化区的设定温度一般要高于混合结晶物熔点15～30 ℃[24]。由于PS-630、HPC、EPO和Soluplus 4种载体的熔点均小于105.5 ℃，故双螺旋挤出机加热区段的温度分别设定为105、120、120、120、120、120、120、105 ℃。螺杆转速设定为80 r/min，待温度达到设定值后，将混匀后的物料从加料口缓慢投入，物料挤出后，收集于铝盘 中，冷却，粉碎，过60目筛，置于干燥器内室温保存备用。 2.3 溶出度实验初筛处方 2.3.1 色谱条件 Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（78∶22）；体积流量为1 mL/min；检测波长为294 nm；柱温为35 ℃；进样量10 μL。 2.3.2 溶出度测定 精密称取Mag、各载体与Mag物理混合物（PM，质量比1∶6）、Mag与各载体制备的固体分散体（SD，各样品中含Mag 20 mg），参照《中国药典》2015年版中桨法进行实验。溶出介质为pH 4.5含0.1%聚山梨酯80的醋酸盐缓冲液900 mL，转速为75 r/min，温度为（37.0±0.1）℃。分别于10、20、40、60、90、120、180、240、300、360、480 min取样5 mL。样品按“2.3.1”项下色谱条件测定。 2.3.3 处方筛选 溶出度结果见图1。PS-630体 系，不同载药量的挤出物在180 min的累积溶出度（D180＝61.13%、71.51%、65.98%）约为Mag （D180＝21.88%）和相应物理混合物（D180＝24.73%）的2.5倍，1∶6载药量挤出物初始溶出速率要高于其他2种载药量。HPC制得的挤出物中，1∶3、1∶6、1∶9 3种载药量的挤出物D180分别为55.62%、67.90%、68.25%，各载药量挤出物溶出性能都优于Mag原料药（D180＝21.88%）和相应的物理混合物（D180＝22.41%）。然而，不同载药量之间的溶出性能也有差异，由图1可知，1∶3比例的挤出物的溶出速率及程度均低于1∶6及1∶9。EPO体系，不同载药量挤出物都能够较短时间内迅速溶解并在10 min内达到峰值，相应物理混合物的累积溶出度在480 min内也能达到挤出物的效果。Soluplus组的溶出曲线展现出了与其他3种载体不同的现象，可以看到由Soluplus制备得到的挤出物并不能提高Mag的溶出度。 图片 对HPC、PS-630和EPO 3种载体而言，1∶3载药量挤出物的溶解性能要劣于1∶6和1∶9。其中PS-630和EPO 2种载体1∶6载药量所得挤出物的溶出性能与1∶9载药量相比并无明显提升。因此选择PS-630、HPC与EPO 3种载体，1∶6载药量挤出物作下一步研究。 2.4 固体分散体的评价 2.4.1 差示扫描量热法（DSC）分析 取样品适量，置于铝制坩埚中，以空白坩埚为参比物，N2为保护气，升温范围为40～200 ℃，升温速率为10 ℃/min，DSC图谱见图2。Mag在105.5 ℃处有1个尖锐的吸热峰，对应Mag熔点。PS-630物理混合物在98 ℃处有1个很小的吸热峰，PS-630制备的挤出物中，105.5 ℃处的特征峰消失，说明Mag是以无定形态分散于挤出物中。Mag在HPC和EPO物理混合物中的特征峰分别在99.5 ℃和105 ℃处，制备得到的挤出物在相应位置的特征峰同样消失，说明Mag也是以无定形态存在的。 图片 2.4.2 X-射线衍射（XPRD）分析 取适量样品进行XPRD实验。工作条件：Cu-Kα靶石墨单色器衍射束单色比，高压40 kV，单流100 mA，扫描2θ角度为3°～80°，步长0.02°，扫描速度为1°/min，结果见图3。Mag在2θ为11.32°、13°、19.54°、19.8°、21.72°、23.02°、26.28°、26.72°和30.54°处有尖锐的晶体衍射峰。药物与各载体物理混合物在相应位置仍保留有这些特征峰，在3种载体制得的挤出物中，这些晶体衍射峰都消失了，说明药物均以非晶态分散于载体中，形成无定形态固体分散体，XPRD的结果与DSC一致。 图片 2.4.3 红外光谱（IR）分析 采用溴化钾压片法测定各样品的IR，波数范围4 000～400 cm−1，分辨率为4 cm−1。结果见图4。从图中发现，Mag芳香环上O-H特征峰振动位于3157 cm−1，脂肪族C=C伸缩振动峰位于1640 cm−1，苯环伸缩振动峰包括 1 610、1 490、1410 cm−1。PS-630红外光谱显示在1 737、1664 cm−1的有C=O伸缩振动峰。Mag和PS-630的物理混合物光谱类似于两者红外图谱的组合图，且在3157 cm−1仍可见较小的伸缩振动。然而Mag与PS-630制备得的固体分散体在3157 cm−1处的伸缩振动几乎消失，说明固体分散体中Mag与PS-630之间可能存在氢键。HPC在3480 cm−1处有O-H伸缩振动，EPO在1730 cm−1处有C=O伸缩振动。这2种基团都有可能与Mag中的O-H在热熔挤出过程中形成氢键。由图4可知，Mag于3157 cm−1处的伸缩振动在与2种聚合物形成的物理混合物中仍然可见，但在制备的固体分散体中伸缩振动消失不见，说明Mag与这2种聚合物在热熔挤出过程中都可能形成了氢键。 图片 2.5 大鼠体内药动学研究 2.5.1 血浆样品的采集与处理 取SD大鼠24只，随机分为4组，按照Mag 20 mg/kg剂量ig Mag原料药、Mag-PS-630（1∶6）固体分散体、Mag-HPC（1∶6）固体分散体、Mag-EPO（1∶6）固体分散体。给药后，分别于5、10、20、30、45 min及1、1.5、2、4、6、8、12、24 h眼眶取血0.5 mL，置于含有10 μL肝素钠的1.5 mL EP管中，6 000 r/min离心6 min，取上清血浆，置于−20 ℃冰箱中冷冻保存备用。取血浆100 μL，加入甲醇和内标（Kae）各10 μL，涡旋混合均匀，加入50 μL浓度为0.05 mol/mL的HCl溶液及1mL的醋酸乙酯溶液，涡旋混合5 min，14 000 r/min离心5 min后，取上清液800 μL，置减压浓缩仪挥干醋酸乙酯，用100 μL流动相复溶，涡旋5 min，14 000 r/min离心10 min，取上清80 μL待测。 2.5.2 血浆样品分析方法的建立 （1）色谱条件：Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温40 ℃；流动相为乙腈-水（25∶75），体积流量0.3 mL/min；进样量5 μL。 （2）质谱条件：电喷雾离子化（ESI），多反应监测离子扫描模式（MRM），负离子模式，离子源温度150 ℃，脱溶剂温度400 ℃，脱溶剂体积流量1000 L/h。Mag m/z 264.9/247.4，保留时间1.44 min；Kae m/z 284.8/92.8，保留时间0.84 min。 2.5.3 方法学验证 （1）标准曲线与线性范围：将对照品用流动相稀释成不同的质量浓度梯度，取对照品10 μL，加入100 μL空白血浆中，按“2.5.1”项下血浆样品处理方法处理，进样检测，以待测成分质量浓度为横坐标（X），待测成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），用加权最小二乘法进行回归运算，得回归方程Y＝0.039 9 X＋1.191 3，r＝0.997 2，线性范围1.045～1 070.500 ng/mL。 （2）专属性：取大鼠空白血浆、空白血浆＋Mag对照品溶液＋内标溶液和给药4 h后血浆样品色谱图进行比较，结果见图5。本实验中Mag与内标互不影响，且大鼠血浆内源性物质不干扰Mag的测定。 图片 （3）精密度与准确度：精密吸取空白血浆100 μL，加入高、中、低质量浓度（40、500、1 000 ng/mL）的对照品溶液10 μL，按“2.5.1”项下方法处理，每种浓度平行5份，处理3批，进样分析，计算准确度和精密度。结果显示Mag的日内精密度RSD分别为11.48%、8.67%、9.27%，准确度分别为107.32%、106.77%、99.45%；日间精密度RSD分别为13.5%、9.73%、12.38%，准确度分别为106.74%、99.72%、103.45%。 （4）稳定性：精密吸取空白血浆100 μL，加入高、中、低质量浓度（40、500、1 000 ng/mL）的对照品溶液10 μL，各浓度平行5份，分别于以下条件保存：室温放置12 h，−20 ℃冻存14 d，室温反复冻融3次。上述样品按“2.5.1”项下方法处理，进样分析，准确度为96.07%～114.93%，稳定性符合要求。 2.5.4 数据处理 所得数据用DAS 3.0药动学软件拟合，药时曲线见图6，经非房室模型计算药动学参数（表2）。Mag单体给药后，Cmax为（65.40±13.74）ng/mL，AUC0~t为（600.35±181.67）ng∙h/mL；Mag-PS-630固体分散体组、Mag-HPC固体分散体组、Mag-EPO固体分散体组Cmax分别为（304.59±136.48）、（151.75±26.37）、（83.49±22.37）ng/mL，AUC0~t分别为（823.81±152.63）、（1 025.90±149.93）、（477.30±159.46）ng∙h/mL。结果表明PS-630和HPC制得的固体分散体能显著提高Mag体内Cmax和AUC0~t，Cmax分别约为Mag单体的5倍和2.3倍，AUC0~t分别提高了37.22%和70.88%。而EPO制得的固体分散体未见体内生物利用度显著性提高。 图片 图片 3 讨论 实验室前期研究发现热熔挤出制备的固体分散体相较于溶剂法、熔融法等传统工艺表现出优异的稳定性[25]。本实验筛选出PS-630和HPC 2种载体，采用热熔挤出法制备了厚朴酚固体分散体，2种载体均能提高厚朴酚的体外溶出和大鼠体内的生物利用度。 对于PS-630和HPC体系，物理混合物的溶出也有轻微的提高，原因为这2种载体均为亲水性材料，具有增溶的作用，但相对于固体分散体，药物并非以无定形态存在，故溶出的提升效果有限[26-27]。对于EPO体系，它能够在酸性溶出介质中迅速溶解，不会在药物表面形成凝胶层阻碍溶出，使得物理混合物长时间的溶出能够达到固体分散体组的效果，这也使得EPO制备得的固体分散体在很短时间内几乎完全溶出[28]。Soluplus是一种专为热熔挤出开发的载体，它的PEG主链连接了疏水性基团，使其水溶性较低，在溶出介质中溶胀缓慢，导致分散在载体中的药物难以溶出[29]。 在溶出度实验中，PS-630、HPC和EPO 3种载体制得的固体分散体均能显著提高厚朴酚的溶出性能，但大鼠体内实验中，由EPO制得的固体分散体未见生物利用度的提高。原因可能为EPO制得的固体分散体在胃中很快溶解形成过饱和溶液，远远超过胃黏膜上皮细胞所能吸收的质量浓度范围，剩余未吸收的药物进入肠道，随着肠道pH的升高，EPO溶解度降低，形成凝胶，导致已经溶解的药物重新被包裹，使得药物的吸收受到阻碍，从而导致生物利用度无提高[28]。 参考文献（略） 来 源：李 杰，杨军辉，蒋志涛，韩 怡，狄留庆，柳春娣. 厚朴酚固体分散体的制备及生物利用度研究 [J]. 中草药, 2019, 50(14):3337-3345.
免 责 申 明： |
