同厚朴酚制剂的制备、表征及其在SD大鼠体内药动学行为比较

发布时间:2022-03-06 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:689

目的制备厚朴酚固体分散体、磷脂复合物和固体脂质纳米粒，并分别比较其在SD大鼠体内的药动学行为。方法溶剂挥发法制备厚朴酚固体分散体和磷脂复合物，采用X射线粉末衍射（X-RayPowder Diffraction，XRPD）技术分析厚朴酚的存在状态。高压均质法制备厚朴酚固体脂质纳米粒，并测定其粒径分布及Zeta电位。以厚朴酚原料药为参考，分别比较固体分散体、磷脂复合物和固体脂质纳米粒的体外溶出情况。SD大鼠分别ig给予厚朴酚、固体分散体、磷脂复合物和固体脂质纳米粒混悬液，HPLC法测定厚朴酚血药浓度，计算主要药动学参数，并比较药动学行为及相对生物利用度。结果厚朴酚在固体分散体和磷脂复合物中均以无定型状态存在。厚朴酚固体脂质纳米粒Zeta电位为（−29.16±1.83）mV，平均粒径为（161.37±3.77）nm。厚朴酚原料药在12 h内的累积溶出度为30.6%，而厚朴酚固体分散体、固体脂质纳米粒和磷脂复合物将其12 h内累积溶出度分别提高至96.3%、76.4%、45.9%。ig给药后Cmax、AUC0～t和AUC0～∞等药动学参数与原料药相比均具有显著提高。其中，磷脂复合物、固体分散体和固体脂质纳米粒将其Cmax由（429.67±53.12）ng/mL分别提高至（533.62±59.01）、（721.73±103.44）、（1 063.21±108.22）ng/mL。相对生物利用度分别提高至1.38、2.12、3.45倍。结论 3种制剂均可提高厚朴酚口服吸收生物利用度，但厚朴酚固体脂质纳米粒效果更为明显。

厚朴是传统中医药广泛使用的一味中药[1]，研究结果显示[2-3]，其主要活性成分之一厚朴酚（magnolol，Mag）具有中枢神经抑制、中枢性肌肉松弛、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、治疗心肌损伤等多种药理活性。但由于溶解度和脂溶性均较差，其生物利用度很低[4]。因此，改善厚朴酚溶解度，促进其体内吸收，是扩大其临床应用首选需要解决的问题。目前已有厚朴酚脂质体、胶束等制剂新技术的研究报道[4-5]。

磷脂复合物（phospholipids complex，PC）技术[6]是将难溶性药物与磷脂或磷脂酰胆碱形成一种复合物后，药物的水溶性及脂溶性可同时得以提高，可促进药物吸收，提高生物利用度。固体分散体（solid dispersion，SD）[7]是将药物分散于亲水性高分子材料（PVK K30、泊洛沙姆188等）中，可增加药物溶解度，促进药物快速溶出进入血液循环，进而提高生物利用度。固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）[8]通过一定的制剂技术，将生理相容性较高的脂质材料与药物制备成粒径在1～1 000 nm的胶粒给药系统，增加药物的溶解度及稳定性，改变吸收途径，提高生物利用度。虽然厚朴酚磷脂复合物和固体分散体已有研究报道[7]，但并未在同一条件下比较二者体内药动学及口服吸收生物利用度提高等情况。本研究首次成功制备了厚朴酚固体脂质纳米粒（Mag-SLN），并比较了Mag- SLN、厚朴酚磷脂复合物（Mag-PC）和厚朴酚固体分散体（Mag-SD）3种制剂在SD大鼠体内的药动学情况，为厚朴酚制剂学研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

FA2204T型电子天平，配备防风罩，Dor Yang公司；1200型HPLC色谱仪，安捷伦公司；CJ-78-1A型磁力搅拌器、DZF-6050型真空干燥箱，上海跃进医疗器械厂；D8 Advance型X粉末射线衍射仪，德国Bruker公司；110-L2型高压均质机，Mfic公司；DW-86L28型超低温冰箱，捷胜公司；Nano ZS90型纳米粒度仪，英国Malvern公司；R200型旋转蒸发仪，BUCHI公司；HF5000型透射电子显微镜（TEMS），200 V，日立高新技术公司；LGJ18-D型冷冻干燥机、HP-15型氮气吹扫仪，舜制仪器公司。

1.2 材料及动物

厚朴酚，批号M160515，质量分数98.0%，旭煌生物科技有限公司；厚朴酚对照品，批号110729- 201508，质量分数98.8%，中国食品药品检定研究院；大豆卵磷脂，批号190511，上海太伟药业有限公司；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30），批号25000240379，Ashland公司；硬脂酸甘油酯，批号20150915，郑州宇控生物科技有限公司；泊洛沙姆188，批号P21489，巴斯夫公司；聚山梨酯80（Tween-80），批号201806-4，上海博湖生物科技有限公司。SD大鼠，体质量（300±20）g，购自河南省实验动物中心，饲养环境：温度为20 ℃，湿度为45%，动物许可证号SCXK（豫）2016-0002。

2 方法与结果

2.1 厚朴酚含量测定

2.1.1 色谱条件色谱柱为Kromasil-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；检测波长293 nm；流动相为甲醇-水（66∶34）；体积流量1.0mL/min；进样体积20 μL。在该色谱条件下，辅料不干扰样品测定，厚朴酚的保留时间为7.50 min，色谱图见图1。

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2.1.2 线性关系考察精密称取厚朴酚12.20 mg，溶解于10 mL量瓶中。采用甲醇-水（76∶34）混合溶液逐步稀释成0.122、0.560、1.220、3.050、6.100、12.200 μg/mL。分别进HPLC色谱仪，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归后得回归方程Y＝17.1283 X－2.8814，r＝0.999 9，结果表明厚朴酚在0.122～12.200 μg/mL线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液的制备取Mag-PC（约10 mg）、Mag-SD（约10 mg）和Mag-SLN（1.0 mL），置于25 mL量瓶中，加甲醇至20 mL后超声5 min，采用甲醇定容至刻度线，混匀后5 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL置于25 mL量瓶中，流动相定容，即得供试品溶液。

2.1.4 精密度试验选择质量浓度为0.122、6.100、12.200 μg/mL的厚朴酚对照品溶液作为低、中、高质量浓度，分别进HPLC色谱仪测定厚朴酚色谱峰面积。计算结果显示，3种质量浓度分别连续进样6次，结果显示日内精密度RSD值分别为0.20%、0.16%、0.32%。3种质量浓度分别每天进样1次，连续6 d，结果显示日间精密度RSD值分别为0.55%、0.78%、0.61%，精密度较高。

2.1.5 稳定性试验取“2.1.3”项下的Mag-PC、Mag-SD和Mag-SLN的供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、12、24、48 h进HPLC色谱仪测定峰面积，计算得3个样品溶液在7个时间点峰面积RSD值分别为0.59%、0.66%、0.81%，样品稳定性较好。

2.1.6 重复性试验分别平行配制Mag-PC、Mag-SD和Mag-SLN 3个样品供试品溶液，各6份，分别进HPLC色谱仪测定厚朴酚含量。结果显示3个样品中厚朴酚质量分数的RSD值分别为1.14%、1.74%、1.33%，说明重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验分别取Mag-PC 11.26 mg、Mag-SD 10.84 mg和Mag-SLN 1.0 mL置于25 mL量瓶中，分别按照制剂中厚朴酚含有量的50%、100%、150%，加入厚朴酚对照品，加甲醇至20mL后超声5 min，采用甲醇定容至刻度线，混匀后5 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL置于25 mL量瓶中，流动相定容，测定厚朴酚总含量，计算回收率。结果显示3个样品平均加样回收率分别为99.11%、98.54%、99.74%，RSD分别为1.49%、1.73%、1.64%。该色谱条件可以用于厚朴酚含量测定。

2.2 Mag-PC的制备及晶型分析

称取0.27 g厚朴酚和0.8 g大豆卵磷脂置100 mL四氢呋喃溶剂中，立即封口。于温度为50 ℃，转速为800 r/min，搅拌反应3.0 h后得澄清溶液。同温度条件下，将澄清溶液采用减压旋蒸除去四氢呋喃，收集残留物，即得Mag-PC。厚朴酚与大豆磷脂的物理混合物按同比例混合，即得。

晶型分析条件：Cu-Kα靶，扫描速度8°/min，电压为40 kV，2θ为3°～45°。分别取适量的厚朴酚、大豆卵磷脂、物理混合物和Mag-PC置于玻璃板凹槽内，进行扫描，图谱见图2。厚朴酚原料药和物理混合物中出现大量晶型峰，大豆卵磷脂仅在3°～9°出现少量晶型峰。但将厚朴酚与大豆卵磷脂制备成Mag-PC后，厚朴酚和大豆卵磷脂的晶型峰均消失，说明厚朴酚的存在状态发生了改变。

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2.3 Mag-SD的制备及晶型分析

分别称取0.27 g厚朴酚和1.35 g的PVP K30置于80 mL无水乙醇中。于温度为50 ℃，转速为800 r/min，搅拌反应5.0 h后得澄清溶液。同温度条件下，将澄清溶液采用减压旋蒸除去无水乙醇，收集残留物，即得Mag-SD。厚朴酚与PVP K30的物理混合物按同比例简单混合，即得。

晶型分析的扫描条件同“2.2”项下。分别取适量的厚朴酚、PVPK30、物理混合物和Mag-SD置于玻璃板凹槽内，用载玻片将样品平面与玻璃面刮齐平后进行扫描，图谱见图3。厚朴酚原料药和物理混合物中同样出现大量晶型峰，但将厚朴酚与PVPK30制备成Mag-SD后，厚朴酚的晶型峰全部消失，说明厚朴酚在Mag-SD中的存在状态发生了改变。

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2.4 Mag-SLN的制备

取单硬脂酸甘油酯240 mg，大豆卵磷脂60 mg和厚朴酚30 mg置于15 mL乙醇，加热至（75±2）℃溶解后即得有机相。取200 mg泊洛沙姆188置于温度为（75±2）℃、体积为20 mL的蒸馏水中即得水相。搅速为1000 r/min，将有机相缓慢滴入水相中，继续搅拌4 h，并浓缩至10 mL后即得初乳。将初乳进行超声15 min（800 W，工作3 s间隔1 s），迅速置于冰箱进行固化20 min（温度为4 ℃），即得Mag-SLN。参考文献方法[8]测定其包封率为78.34%，载药量为6.16%。

2.5 Mag-SLN的表征

2.5.1 粒径分布及Zeta电位取3批Mag-SLN混悬液，采用蒸馏水按照1∶15进行稀释，测得平均粒径为（161.37±3.77）nm，PDI为0.108±0.022（图4），测得平均Zeta电位为（−29.16±1.83）mV（图5）。

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2.5.2 外貌观察取Mag-SLN混悬液，滴加在附有支持膜的铜网上，用滤纸吸干多余液体。静置晾干后置于透射电镜下并拍照，结果见图6。制备的Mag-SLN为近似球形或椭球形，粒子之间无黏连。

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2.6 Mag-SLN冻干粉的制备

采用乳糖作为冻干保护剂。取Mag-SLN混悬液5 mL置于西林瓶中，加入10 mg/mL的乳糖溶液，混匀。于−55 ℃预冻12 h后，放入冻干机中，于温度为−45～−30 ℃真空干燥约48 h，缓慢升温至25 ℃，保持6 h即得Mag-SLN冻干粉。

2.7 3种制剂体外溶出情况比较

取Mag-PC、Mag-SD和Mag-SLN冻干粉适量（厚朴酚含有量均为10.0 mg），采用溶出介质制备混悬液后，转移至透析袋中（截留相对分子质量为8000～12 000）。采用含0.1%的聚山梨酯80的pH值为4.5醋酸盐缓冲液作为溶出介质，体积为900 mL，转速为100 r/min，温度为37 ℃。各时间点取样3 mL，及时补加空白介质3 mL。HPLC测定厚朴酚的含量，计算累积溶出度，绘制溶出曲线，结果见图7。厚朴酚原料药在12 h内的累积溶出度为30.6%，而Mag-SD、Mag-SLN和Mag-PC分别将厚朴酚的12 h内累积溶出度提高至96.3%、76.4%、45.9%。在初始阶段，Mag-SD溶出速率最快，而Mag-PC和Mag-SLN具有明显的缓释特征，但Mag-SLN在各个时间点的累积溶出度均高于Mag-PC或厚朴酚原料药。

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2.8 SD大鼠体内药动学研究

2.8.1 分组及血样采集取24只大鼠，雌雄兼用，随机分为4组即厚朴酚组、Mag-PC组、Mag-SD组和Mag-SLN组，给药剂量均为80 mg/kg。实验前全部禁食1 d，不禁水。准备肝素浸润的离心管若干，各组实验大鼠于ig给药后0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12 h眼眶静脉丛取血约0.2～0.3 mL，置于肝素化离心管，震荡混匀后，立即3 000 r/min离心2 min，于−20 ℃条件下冷冻保存血浆。

2.8.2 血浆样品的处理[9] 取SD大鼠，麻醉后心脏取血，离心后取上层血浆，即得空白血浆，备用。精密吸取200 μL解冻后血浆样品于离心管中，加醋酸乙酯1.0 mL，涡旋震荡3 min，静置1 min后继续涡旋震荡3 min。8 000 r/min离心2 min后取上层有机相，45 ℃条件下氮气吹干。加入甲醇200 μL，10 000 r/min离心6 min，即得血浆样品溶液。其中药动学研究HPLC流动相调整为甲醇-水（58∶42），其他色谱条件均不变。空白血浆、血浆样品和血浆对照品HPLC色谱图见图8。

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2.8.3 血浆对照品的配制及线性关系考察采用空白血浆配制质量浓度为30.5、61.0、122.0、305.0、610.0、1 220.0 ng/mL的一系列厚朴酚血浆对照品溶液。按照“2.8.2”项方法处理，即得血浆对照品溶液，取20 μL进HPLC。以质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），进行线性回归后得回归方程Y＝0.013 1 X－5.357 3，r＝0.999 1。结果表明，厚朴酚在30.5～1 220.0 ng/mL线性关系良好。

2.8.4 方法学验证取血浆样品于0、12、24、48、60、72 h经反复冷冻、溶解后进HPLC色谱仪测定厚朴酚峰面积，计算得RSD值为10.38%，说明血浆样品在72 h内经反复冷冻、溶解后仍基本稳定。

选30.5、610.0、1 220.0 ng/mL3个质量浓度血浆对照品溶液作为低、中、高质量浓度。分别连续进样6次，即得日间精密度的RSD值依次为11.36%、9.69%、7.03%（n＝6）；每天进样1次，连续6 d，即得日内精密度RSD值依次为8.11%、6.84%、6.03%（n＝6）。

采用空白血浆配制30.5、610.0、1 220.0 ng/mL 3个质量浓度的血浆样品，经处理后进HPLC色谱仪测定峰面积，按照回归方程Y＝0.013 1 X－5.357 3，计算测定值，与实际配制质量浓度相比得出的回收率分别为90.69%、95.42%、91.97%，对应的RSD分别为7.66%、8.84%、9.16%。所以建立的血浆处理方法及色谱方法可用于血浆样品中厚朴酚的含量测定。

2.8.5 体内药动学研究取厚朴酚组、Mag-PC组、Mag-SD组和Mag-SLN组血浆样品，按照“2.8.2”项下方法处理后进行含量测定，并绘制药-时曲线，结果见图9。采用DAS2.0药动学软件包自动拟合数据，结果见表1。厚朴酚组的tmax、Cmax、AUC0～t分别为（0.78±0.23）h、（429.67±53.12）ng/mL、（1 217.81±153.29）ng∙h/mL。制备成Mag-SD后，其tmax显著性提前至（0.49±0.16）h，而Mag-SLN组的tmax显著性延后至（1.26±0.34）h，Mag-PC组的tmax为（0.86±0.28）h，有所延后，但不具有显著差异（P＞0.05）。Mag-PC组、Mag-SD组和Mag-SLN的Cmax分别提高至（533.62±59.01）、（721.73±103.44）、（1 063.21±108.22）ng/mL，且均有显著性差异（P＜0.05、0.01），说明3种制剂均可促进厚朴酚体内吸收。与厚朴酚原料药组相比，Mag-PC组、Mag-SD组和Mag-SLN组的口服相对生物利用度提高至1.38、2.12、3.45倍。
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3 讨论

3.1 血浆样品的处理

在药动学研究中，血浆样品的处理过程对实验结果的准确性有较大影响。课题组曾经考虑采用有机溶剂（甲醇、乙腈等）沉淀蛋白，再用醋酸乙酯萃取，但回收率仅仅在54.11%～68.79%。而采用醋酸乙酯直接萃取时，回收率反而增加至90.69%～95.42%。研究结果显示[9]，厚朴酚与血浆蛋白之间可能会产生静电作用力及氢键作用力等，导致有机溶剂沉淀蛋白时，厚朴酚与血浆蛋白结合较为紧密。因此，最终选择醋酸乙酯直接萃取进行测定，且操作过程大为简化。

3.2 药物存在状态对溶出及药动学的影响

无定型状态是一种特殊的晶型，当药物以无定型状态存在时，其各种理化性质、溶出速率、生物利用度等往往得到较大改变[10]。由于制备方法或辅料的不同，可以得到不同的无定型状态物质。同一物质不同无定型状态的溶出速率、生物利用度情况等可能有所不同。本研究分别尝试采用磷脂（Mag-PC）和PVP K30（Mag-SD）制备了厚朴酚2种无定型状态物质，但两者在体外溶出和体内吸收表现出较大差别。Mag-PC在整个体外溶出过程均比较非常缓慢，而Mag-SD仅用45 min左右时间实现几乎全部溶出。

体内药动学研究结果显示，Mag-SD的tmax显著性提前，而Mag-PC的tmax却无显著性差异。Mag-PC组的相对生物利用度提高至1.38倍，而Mag-SD组提高至2.12倍。据报道[11-12]，PC的制备需要在非质子溶剂中进行，当PC接触水相（质子溶剂）后，破坏了药物与磷脂之间的氢键、范德华力等，导致药物与磷脂之间发生解离，促吸收作用受到极大影响。因而在PC、SD和SLN 3种制剂中，PC生物利用度提高幅度相对较低。

3.3 纳米技术提高生物利用度机制及优势

纳米技术提高药物生物利用度除了提高药物溶解度及溶出度等有关外，还与SLN在体内特殊的吸收机制有很大关系[13-16]。Mag-SLN的tmax显著性延后，除了与SLN本身具有缓释作用外，可能还与SLN在胃肠道壁上被暂时吸附或发生滞留有关[12,16]。与原料药组相比，Mag-SLN组的口服相对生物利用度提高至3.45倍。虽然Mag-SD药物溶出速率和溶出度最大，但生物利用度低于Mag-SLN，可能是胃肠道稳定性、渗透性、pH值等因素影响了SD中药物的顺利吸收[17-19]。纳米制剂的包裹作用能明显提高药物的稳定性[20-22]，此外纳米制剂通过减小粒径，增加比表面积，增加溶解度及渗透性等改变了药物的组织分布和药动学行为，极大提高了生物利用度，也为药效的提高奠定基础[23]。虽然SLN促吸收效果更为明显，但制备工艺复杂程度、设备条件及制剂技术等要求也相对较高。

参考文献（略）

来源：刘会珍，董丹丹，范明松．不同厚朴酚制剂的制备、表征及其在SD大鼠体内药动学行为比较 [J]. 中草药, 2020, 51(17):4442-4448.

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