Stabil ity of Dihydromyricetin and Factors Affecting the Stabil ity

L IN Shu2ying1 , GAO J ian2hua1 , GUO Qing2quan2 , NIN G Zheng2xiang1

(1. CollegeofFoodand Biotechnology ,SouthChinaUniversityof Technology ,Guangzhou510640 ,China; 2. Institute

of Chemical Engineering ,SouthChinaUniversityof Technology ,Guangzhou510640 ,China)

Abstract : Dihydromyricetin is an important kind of flavonol. It has some health protection functions

and antioxidation activity to TBHQ. The solubility of dihydromyricetin with the way of dissolving 2

separating out2 quantifying weight was studied and changes in chemical st ructure of dihydromyricetin

was confirmed by ult raviolet/ visible region scan. The result showed that dihydromyricetin was

unstable in water , unless it existed in aqueous phase under100 ℃for less than 30 min. Under the

acidic and neut ral conditions , the chemical st ructure of dihydromyricetin was stable. In the processes

of ext racting and using dihydromyricetin , metal ion sould be wiped off , as t ransitional metal ions such

as Al3 + 、Fe3 + 、Cu2 + could induce oxidation.

Key words : dihydromyricetin ; spect rum ; pH2value ; chemical st ructure ; stability

二氢杨梅素(3 ,5 ,7 ,3’,4’,5’2 六羟基22 ,3 双氢黄酮醇,Dihydromyricetin ,DMY) 是多酚羟基双氢黄酮醇,属黄酮类化合物,广泛存在于葡萄科植物中,尤其是在蛇葡萄属植物中,在显齿蛇葡萄植物的幼嫩茎叶中,其质量分数可达20 %～28 %(占干重) ,

幼叶中的含量更高[1. 2 ] . 用显齿蛇葡萄幼叶制成的类茶产品具有消炎、止咳、祛痰、镇痛、抑菌[3 ,4 ] 、抗高血压、消脂[5 ] 、防癌、保肝护肝[6 ] 等显著功效. 除此之外,二氢杨梅素还具有优异的防腐和抗氧化性能,有望成为新型的天然防腐剂和抗氧化剂,具有广阔的开发前景.

鉴于显齿蛇葡萄的特殊功效,对于二氢杨梅素提取和生理活性的研究日趋活跃. 目前的研究主要集中在两个方面:一是溶剂提取法,包括复合有机溶剂法和水浸提法[7 ] ;二是层析法,主要为大孔吸附树脂提取法[8～10 ] .黄酮类物质均具有一定紫外2可见吸收光谱[11 ] ,紫外2可见吸收光谱扫描法可准确、快速地测定出其化学结构是否发生变化,因此作者主要采用紫外2可见光谱扫描法研究pH 值、温度以及金属离子对于二氢杨梅素化学结构稳定性、溶解度以及色

泽的影响,为其在食品、医药及化妆品工业中应用提供一定的依据.

1 材料与方法

1. 1 实验材料、仪器与试剂

实验材料:显齿蛇葡萄幼嫩叶,采自广东白云山,依文献鉴定为原植物;实验仪器:紫外2可见分光光度计,电子天平,恒温仪;所用化学试剂均为分析纯.

1. 2 实验方法

1. 2. 1 二氢杨梅素的提取制备　取蛇葡萄幼嫩干叶,加水煎煮,浓缩过滤后,放置,待析出浅黄色颗粒状结晶后,抽滤干燥,得到粗品; 用索式抽提器抽提粗品,浓缩下层溶液,按质量比1∶100 加蒸馏水稀释,过滤后放置,析出白色结晶;所得结晶再依上法进行数次重结晶,最后得白色细针状结晶,即二氢杨梅素,经高效液相色谱测定,纯度为95 %.

1. 2. 2 二氢杨梅素水相热稳定性的检测　取0.5 g二氢杨梅素(纯度> 95 %) 溶于900 mL 水中,煮沸,分别在0～600 min 取样5 mL ,于25 mL 容量瓶中定容,在200～800 nm 的波长范围扫描.

1. 2. 3 pH 值变化对于二氢杨梅素稳定性的检测　称取二氢杨梅素(纯度> 95 %) 1. 0～1.5 g于不同pH 值的水溶液中,加热至100 ℃保持5 min 待其溶解,冷却至室温,72 h 后观察结晶状态、颜色以及上清液颜色差异,真空抽滤后,称量滤渣质量,计算二氢杨梅素在不同pH 值下的溶解度. 取上清液进行波长在220～800 nm 的紫外2可见光谱扫描,比较不同pH 值下的稳定性.

1. 2. 4 金属离子对于二氢杨梅素稳定性的检测　称取二氢杨梅素(纯度> 95 %) 0.05 g左右,溶于2 000 mL 蒸馏水中备用. 取以上样品50 mL ,加入1mL 0. 1 mol/ L 的金属离子溶液,混匀后静置6 h 后在200～800 nm 波长范围扫描.

2 结果与讨论

2. 1 水相二氢杨梅素的热稳定性

研究发现,二氢杨梅素的热稳定性与时间关系密切,由图1a 所示,二氢杨梅素水溶液100 ℃下加热30 min 其紫外可见光谱图未见改变,图中所示的峰高不同为随时间延长,水蒸气蒸发导致溶质质量浓度升高所致;但图1 所示的加热35 min 后,随加热时间的延长,溶液的紫外可见扫描光谱图发生了很大变化,其在紫外光区的最大吸收峰294 nm 和324 nm 左右的峰肩没有发生变化,但峰高比例下降,同时在350～400 nm 之间又出现吸收有较为明显的增强趋势,并且随加热时间的延长其峰高不断增加,溶液也出现了肉眼可见的颜色加深现象.

(a)

(b)

图1 100 ℃下不同时间水相二氢杨梅素的紫外2可见

光谱图

Fig. 1 Ultraviolet/ visible region spectrum of DMY in

water at different heating time under100 ℃

以上现象均表明: 水相中随着加热时间的延长,二氢杨梅素的构型发生了变化,产生了在370nm 处有较大吸收的基团,并且加热时间越长,产生的该物质越多. 以上变化可能是由于二氢杨梅素的氧化引起的,氧化后的二氢杨梅素变成亚醌式结构,B 环发生断裂,并且随着加热时间的延长,氧化程度不断加深,导致370 nm 左右的吸收不断增强,294 nm 处的吸收逐渐减少,表明二氢杨梅素在水相中随时间和温度的增加会变得不稳定,发生氧化,且一定程度不可逆.

另外需要指出,前期研究中采用DSC 差热扫描仪对于二氢杨梅素的热稳定性进行了研究[12 ] ,发现其熔点为245 ℃左右,高于此温度就会发生分解,而低于此温度在没有其他介质条件下,二氢杨梅素在干燥条件下则表现出非常好的热稳定性. 在二氢杨梅素溶液中,水充当媒介,从而为溶解态的二氢杨梅素的氧化提供了条件,氧化后的二氢杨梅素转变为醌式结构,从而引起解环.

2. 2 pH值对于二氢杨梅素稳定性的影响

由图2～4 可见,随着pH 值的增大,二氢杨梅

素的紫外可见光谱图发生了显著变化.

图2 酸性条件对于二氢杨梅素结构的影响

Fig. 2 Effect of acidity condition on chemical structure of

DMY

图3 中性条件对于二氢杨梅素结构的影响

Fig. 3 Effect of neutral condition on chemical structure of

图4 碱性条件对于二氢杨梅素结构的影响

Fig. 4 Effect of alkaline condition on chemical structure of

DMY

在酸性(pH 值2. 0～3. 5) 条件下,二氢杨梅素在294 nm 下有特征吸收峰,在324 nm 左右有肩峰,可见光区没有明显的特征吸收峰出现,且pH 值变化特征吸收峰没有发生改变,说明酸性条件下二氢杨梅素构型稳定. 中性条件下,其294 nm 下的吸收峰有所减小,而324 nm 左右的肩峰明显增高,可见光区仍无明显吸收,说明二氢杨梅素的构型已部分发生变化,即只是很少部分的量变. 在324 nm 左右的肩峰增大表明,二氢杨梅素分子上的羟基部分解离,这是由于二氢杨梅素分子中含有6 个酚羟基,具有弱酸性,等电点接近pH 值5 左右,因此随着碱的加入,酚羟基开始解离,但这种解离并未引起整个分子的构型变化,其特征吸收峰仍为294 nm和324 nm.

在碱性条件下,二氢杨梅素的构型发生了明显变化,其在294 nm 处的吸收峰消失,在324 nm 左

右的吸收峰明显增大,同时在可见光区498 nm 左右出现了明显吸收,低质量浓度二氢杨梅素溶液的颜色由微黄色变为浅棕色(见表2) ,即随着强碱的加入,其分子上的酚羟基逐渐解离,同时由于酚羟基的解离,改变了分子上的电子云分布,从而使分子发生了彻底的构型转换,在B 环的氧原子处发生解环,生成了A 环上的一个羟基,类似于查尔酮结构,故引起相应峰带红移20 nm ,并在498 nm 可见光区处出现吸收峰.因此,由以上的分析可知,酸性和中性条件为

二氢杨梅素应用和保藏的适宜pH 值条件,要避免在碱性条件下应用,否则会失去其原有的抗氧化效果.

由表1 ,2 可见,pH 值对二氢杨梅素的溶解度影响较小,在pH 值4～5 左右溶解度较小,性范围内溶解度较高,但是对于结晶纯化产品品质影响较大,其中pH 值过高都会产生不良的颜色变化. 其水溶液颜色在pH 值4～6 表现出较好的淡黄色,保证其浅淡的颜色不影响应用. 虽然在此范围内其溶解度最低,但前期研究表明作为抗氧化剂和防腐剂应用其添加量一般不超过0. 06 %[4 ,12 ,13 ] ,因此并不限制其应用,同时可稳定其结构,综上所述,建议在pH 值4～6 左右的微酸性条件下应用和保存二氢杨梅素,从而取得较好抗氧化和抑菌的效果.

表1 pH值对于DMY 结晶颜色和同质量浓度DMY 溶液

颜色的影响

Tab. 1 Effect of pHvalue on crystal color of DMY and same

concentration DMY solution

pH 值结晶颜色溶液颜色

1. 5 黄色微黄色

2. 0 黄色微黄色

3. 0 黄色微黄色

4. 0 黄白色微黄色

5. 0 黄白色淡黄色

6. 0 橙色淡黄色

7. 0 橙色较黄色

8. 0 土黄色深黄色

10. 0 土黄色棕色

表2 pH值对于二氢杨梅素的溶解度的影响

Tab. 2 Effect of pHvalue on solubility of DMY

pH 值溶解度/ (g/ hg) pH 值溶解度/ (g/ hg)

1. 5 0. 0680 4. 0 0. 0588

2. 0 0. 0670 5. 0 0. 0688

3. 0 0. 0670 7. 0 0. 0732

2. 3 金属离子对于二氢杨梅素稳定性的影响

金属离子存在于各种食品原辅料中,并可通过加工或提取等工艺引入到食品体系,因此研究金属离子对二氢杨梅素稳定性的影响就显得非常必要.作者发现二氢杨梅素对于金属离子的敏感程度不尽相同,需指出因加入的金属离子浓度很低(0. 2mmol/ L) ,而且均为金属氯化物,因此对pH 值的影响很小,可忽略. 由图5 可见,Al3 + ,Fe3 + ,Cu2 + 表现出较为明显的作用(加入0. 2 mmol/ L 浓度的Fe3 +二氢杨梅素溶液浓度,因吸光值增大较多,稀释了4倍进行测定) ,这是因为二氢杨梅素螯合金属离子Al3 + ,形成了二氢杨梅素铝络合物,非共有电子增多,n →π共轭加强,所以出现了红移效应. 而Fe3 + ,Cu2 + 引起其吸收光谱较大改变,是因为过渡态的高价金属离子是许多自由基产生过程的催化剂,鳌合金属离子也是二氢杨梅素的抗氧化作用机制之一,

二氢杨梅素鳌合Fe3 + ,Cu2 + 后发生了氧化反应,因此结构发生了彻底的改变导致其吸收光谱的改变.鳌合金属离子也是二氢杨梅素抗氧化作用机制之一.

图5 金属离子与二氢杨梅素作用的紫外2可见光谱图

Fig. 5 Ultraviolet/ visible region spectrum of interactionof DMY and metal ions

3 结　论

1) 二氢杨梅素在水相中随时间和温度的增加会变得不稳定,发生氧化,且不可逆,建议在提取和加工过程中避免过高的加热温度,以达到沸腾不超过30 min 为宜.

2) pH 值是影响二氢杨梅素稳定性的重要因素. 酸性和中性条件(pH < 7. 0) 为二氢杨梅素应用和保藏的适宜pH 值条件.

3) 金属离子Ca2 + ,Mg2 + ,Na + ,NH4 + ,Ba2 + 对于二氢杨梅素稳定性均无明显的作用, 而Al3 + ,

Fe3 + ,Cu2 + 则是二氢杨梅素提取和应用过程中要避免接触的.

[2 ] 陈德慰. 绿色蔬菜中金属离子络合物的研究进展[J ] . 无锡轻工大学学报,2001 , (4) :440 - 443.

[3 ] 詹沛鑫. pH 值对加热绿色蔬菜中叶绿素形成的影响———亨盖特Lab 色度法[J ] . 食品与发酵工业,1997 , (6) :50 - 52.

[4 ] 祝美云. 不同护绿液对罐头蕨菜护绿效果的影响[J ] . 河南农业大学学报,2002 , (3) :260 - 262.

[5 ] 周涛. 热处理对微加工茭白的质构和色泽的影响[J ] . 无锡轻工大学学报,2002 , (3) :281 - 284.

[ 6 ] Derek R Haisman. The Interfacial factor in the heat2 induced conversion of chlorophyll to pheophytin in green leaves[J ] . J Sci Fd

Agric ,1975 ,26 :1111 - 1126.

[7 ] 陈文峻. 植物叶绿素的降解[J ] . 植物生理学通讯,2001 , (4) :336 - 339.

[8 ] Luke F LaBorde. Zinc complex formation in heated vegetable purees[J ] . J agric Food Chem, 1990 ,38 :484 - 487.

[9 ] Sigmund H Schanderl. Color reversion in processed vegetables[J ] . J agric Food Chem, 1979 ,24 :312 - 315.

[ 2 ] 何桂霞,裴刚,周天达,等. 显齿蛇葡萄中总黄酮和二氢杨梅素的含量测定[J ] . 中国中药杂志, 2000 , 25 (7) :423, - 425.

[ 3 ] Matsumoto T , Tahara S . Ampelopsin , a major antifungal constituent from Salix sachalinensis ,and its methyl ethers[J ] . Nip2

pon nogeikagaku kaishi , 2001 , 75 (6) :659 - 667.

[ 4 ] 杨书珍,张友胜,宁正祥,等. 二氢杨梅素对几种食品常见菌的抑制效果[J ] . 天然产物研究与开发,2003 , (1) :40 - 42.

[ 5 ] 周雪仙, 周天达, 谭春生. 双氢杨梅树皮素对兔胸主动脉条平滑肌收缩反应的影响[J ] . 现代应用药学, 1997 , 14 (2) :8

- 11.

[ 6 ] Yabe N , Tanaka K, Matsui H. An ethanol2extract of A mpelopsis brevipedunculata ( vitacease) berries decreases ferrous iron2

stimulated bepatocyte injury in culture[J ] . Journal of Ethnopharmcology , 1998 ,59 (3) :147 - 159.

[ 7 ] 周天达,周雪仙. 藤茶中双氢黄酮醇的分离结构鉴定及药理活性[J ] . 中国药学杂志,1996 ,31 (8) :458.

[ 8 ] . 张友胜,杨伟丽,胡自勇.“增温溶解,保温过柱,温水解吸”提制二氢杨梅素(一) [J ] . 天然产物研究与开发, 2002 , (3) :

50 - 53.

[ 9 ] . 张友胜,杨伟丽,胡自勇.“增温溶解,保温过柱,温水解吸”提制二氢杨梅素(二) [J ] . 天然产物研究与开发, 2002 , (4) :

38 - 41.

[ 10 ] Qizhen Du , Weijian Cai , Ming Xia , et al . Purification of ( + )2dihydromyricetin from leaves extract of A mpelopsis grosseden2

tata using high2speed countercurrent chromatograph with scale2up triple columns[J ] . Journal of Chromatography A, 2002 ,9

(73) :217 - 220.

[11 ] 田燕. 紫外2可见光谱在黄酮类鉴定中的应用[J ] . 大连医科大学学报, 2002 , (3) :213 - 214.

[12 ] 林淑英, 张友胜, 郭清泉,等. 天然抗氧化剂二氢杨梅素的热稳定性及抗氧化性质研究[J ] . 现代化工,2003 , (增刊) :191

- 193.

[13 ] 林淑英, 张友胜, 宁正祥,等. 二氢杨梅素在猪油体系中的抗氧化作用研究[J ] . 食品科技, 2003 , (4) :71 - 74.