大黄素抑制系膜细胞增生与周期素激酶抑制剂p27 的关系 |
发布时间:2010-11-02 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2246 |
梅小斌, 袁伟杰, 湛冯兰, 吴灏, 张晓瑛, 崔若兰 ( 第二军医大学附属长海医院肾内科, 上海200433) [ 摘要] 目的: 探讨周期素激酶抑制剂p27 在大黄素抑制肾系膜细胞( mesangial cell, MC) 增生中的作用。方法: 蛋白印迹( western 杂交) 方法测定MC 裂解液p27 蛋白水平, [ 3 H] 胸腺嘧啶核苷( [ 3H] TdR) 测定MC 增生的情况, 观察不同浓度大黄素( 50 mg/L、100 mg/L ) 对肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor-α, TNF-α) 刺激的MC 中p27 水平及增生程度的影响。结果:TNF-α( 20 万U/L) 使无血清培养24 h 的MC 中p27 水平降低, 同时使[ 3H] TdR 掺入增加; 大黄素提高TNF-α刺激的MC 中p27 水平, 同时使[ 3H] TdR 掺入减少。大黄素的上述作用随剂量的增大而增强。结论: 大黄素可能通过提高p27 水平抑制TNF-α诱导的MC 增生。 [ 关键词] 大黄素; 周期素激酶抑制剂; 肿瘤坏死因子-α; 系膜细胞 体内外研究证实大黄素能有效抑制肾系膜细胞( mesangial cell, MC) 及成纤维细胞增生[ 1 ~4] , 细胞增生与否受细胞周期调节蛋白( cell cycle regulatory proteins, CCRPs) 控制[ 5 ] , 其中周期素激酶抑制剂p27 是一种十分重要的CCRPs, 我们[ 6 , 7 ] 及Shankland 等[ 8] 的研究证实p27 水平下降在MC 增生中起重要作用。目前有关p27 与大黄素抑制MC 增生关系的报道较少见, 故本研究旨在探讨p27 在大黄素抑制肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor-α, TNF-α) 诱导的MC 增生中的作用, 为防治系膜增生性肾炎提供理论依据。 1 材料和方法 1 . 1 细胞培养SD 大鼠MC 按谌贻璞等[ 9 ] 方法培养和鉴定, 该MC 星形, 抗desmin 和抗vimetin 染色阳性, 抗Ⅷ 因子染色阴性。SD 大鼠MC 培养于含10% 小牛血清的正常糖( 1 000 mg /L) DMEM( Gibco公司产品) 中, 常规置于37℃、5% CO2 培养箱中孵育, 每周传代2 ~3 次。 1 . 2 实验分组104 MC 培养于96 孔板( 美国Costar 公司产品) 中, 进入实验前行无血清正常糖培养24 h, 然后分别无血清正常糖( 正常对照组) , 或无血清正常糖+ TNF-α20 万U/L( TNF-α组) , 或无血清正常糖+ TNF-α20 万U/L + 大黄素50 mg /L( 50 mg /L 大黄素组) , 或无血清正常糖+ TNF-α20 万U/L + 大黄素100 mg /L( 100 mg /L 大黄素组)培养24 h。TNF-α由第二军医大学神经生物学教研室馈赠; 大黄素由第二军医大学生药学教研室陈万生教授提纯馈赠, 经高压液相检测纯度在90% 以上。 1 . 3 [ 3H] 胸腺嘧啶核苷掺入上述组别的MC 在培养的最后6 h 每孔加入1 μCi [ 3 H] 胸腺嘧啶核苷( [ 3H] TdR) 。胰酶消化后用自动细胞收集器收集细胞于纤维滤纸上, 滤纸干燥后加入液闪液, 液闪计数。 1 . 4 蛋白印迹用蛋白印迹( western 杂交) 方法测定MC 裂解液p27 蛋白水平。三去污剂裂解缓冲液( 1% SDS、1% NP- 40、5% 去氧胆酸钠等) 裂解上述组别的MC, 4 ℃, 14 000 r /min 离心, 改良Lowry 法测定上清液蛋白浓度; 调整每个样本的蛋白浓度至80 μg /15 μl, 15% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺( SDS-PAGE) 凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜上;小鼠p27 单克隆抗体( 1∶ 500 稀释, Santa Cruz 公司) 杂交1 h, 洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠多抗( 1∶ 500 稀释, 华美生物用品公司) 杂交1 h; 洗膜后加ECL( 增强化学发光) 试剂( 上海吉泰科技公司) , 然后将硝酸纤维素膜放入X 光片暗盒,压片, 显影, 定影。利用图象分析系统( 上海复日科技有限公司) 扫描确定X 光片上杂交条带的相对光 密度值( 无血清正常糖培养24 h 的MC 中p27 光密度值为相对值1) 。 1 . 5 统计学方法所有数据均用x ±s 表示, 组间数据比较采用方差分析。 2 结果 2 . 1 大黄素对TNF-α刺激的MC [ 3H] TdR 掺入的影响TNF-α使无血清培养24 h MC 中[ 3H] TdR 掺入增加; 大黄素抑制TNF-α刺激的MC [ 3H] TdR 掺入, 随着大黄素剂量的增加, 此抑制作用愈强。见表1。 2 . 2 大黄素对TNF-α刺激的MC 中p27 水平的影响TNF-α刺激24 h 的MC 中p27 水平明显下降;大黄素提高TNF-α刺激的MC 中p27 水平, 随着大黄素剂量的增加, 其提高p27 水平的作用愈强。见图1、表2。 3 讨论 MC 增生是各种肾炎、肾病综合征等肾脏疾病的常见病理现象, 增生的MC 分泌较多的细胞外基质蛋白, 因此MC 增生长期存在可导致肾脏纤维化, 以至肾衰竭, 抑制系膜细胞增生对预防肾衰竭有重要的意义。大黄素是中药大黄的活性单体成分, 其结构为1 , 6, 8-三羟基-3- 4 甲基蒽醌。本实验证实,TNF-α使无血清培养24 h 的MC 中[ 3H] TdR 掺入增加, 大黄素抑制TNF-α刺激的MC [ 3 H] TdR 掺入, 随着大黄素剂量的增加, 此抑制作用愈强, 提示大黄素可抑制TNF-α诱导的MC 增生。体内外研究也证实大黄素能有效抑制肾MC、成纤维细胞的增生[ 1 ~4 ] 。大黄素可抑制系膜细胞增生、降低细胞增殖性核抗原( proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 表达[ 1] ; 可使抗肾小球基底膜肾炎大鼠肾小球细胞总数及新月体数减少[ 2 ] ; 可通过抑制人肾成纤维细胞DNA合成, 延迟细胞周期的进程, 抑制细胞增生[ 3 , 4 ] 。调节细胞是否增生( 细胞能否通过细胞周期中的G1 /S 检验点) 的物质是CCRPs。CCRPs 分为正CCRPs( 周期素, 周期素依赖性激酶) 及负CCRPs( 周期素激酶抑制剂) 。前者的主要生物效能为促进细胞周期的运转, 而后者的主要生物效能为抑制细胞周期的运转[ 5 ] 。如果周期素激酶抑制剂( cyclin-kinase inhibitor, CKI) 对G1 / S 转换的抑制作用小于正CCRPs 的促进作用, 则细胞增生。 本研究发现, TNF-α刺激的MC 中p27 水平明显下降, 大黄素提高TNF-α刺激的MC 中p27 水平,随着大黄素剂量的增加, 其提高p27 水平的作用愈强, 这些结果提示大黄素可提高TNF-α刺激的MC中p27 水平, 而p27 水平的上升抑制了G1 /S 的转换, 从而抑制MC 的增生。Terada 等[ 10] 证实舒降之( lovastatin) 通过提高p27 蛋白水平抑制MC 的增 生, 该结果支持大黄素可能通过提高p27 水平抑制TNF-α刺激的MC 增生。目前不清楚大黄素提高MC 中p27 水平的机制。有报道认为大黄素阻滞钙通道, 使钙内流受阻, 影响CCRPs 的表达或降解[ 11 , 12 ] , 从而可能引起p27 水平的下降。 总之, 大黄素可使TNF-α刺激的MC [ 3 H] TdR掺入减少及p27 水平升高, 随着大黄素剂量的增加,其上述作用愈强, 提示p27 水平上升可能在大黄素抑制TNF-α诱导的MC 增生中起重要作用。 [ 参考文献] 1 刘志红, 黎磊石. 大黄素对肾小球系膜细胞PCNA 的影响[ J] . 细胞生物学杂志, 1993, 15( 4) : 174 -176. 2 戴春笋, 刘志红, 陈惠萍, 等. 大黄素与雷公藤酯醇联合治疗大鼠抗肾小球基底膜肾炎的试验研究[ J ] . 肾脏病透析与移植杂志,2000, 9( 2) : 117-123. 3 刘冠贤, 叶任高, 谭志明, 等. 大黄素对狼疮性肾炎成纤维细胞生物学行为的影响[ J ] . 中国中西医结合杂志, 2000, 20( 3) : 196-198. 4 王晓玲, 王俭勤, 夏延龄, 等. 大黄素对人肾成纤维细胞抑制作用的研究[ J] . 中国中西医结合肾病杂志, 2002, 3( 11) : 629- 631. 5 Shankland SJ . Cell-cycle control and renal dis ease [ J ] . Kidney Int ,1997, 52 ( 2) : 294-308 . 6 梅小斌, 崔若兰, 高从容, 等. Thy1 肾炎大鼠肾小球周期素激酶抑制剂p27 的变化[ J ] . 中华肾脏病杂志, 2001, 17 ( 5) : 335-336 . 7 梅小斌, 崔若兰, 高从容, 等. 周期素激酶抑制剂p27 在肿瘤坏死因子-α诱导系膜细胞增生中的作用[ J ] , 中华内科杂志,2002, 41( 9) : 599- 601. 8 Shankland SJ, Pippin J, Flanagan M, et a l. Mesangial cel l proliferation mediated by PDGF and bFGF is determined by levels of the cyclin kinase inhibitor p27 Kip1 [ J ] . Kidney Int , 1997 , 51( 4 ) : 1088 -1099. 9 谌贻璞, 高进, 邢宝才, 等. 肾小球系膜细胞培养[ J ] . 北京医科大学学报, 1989 , 21 ( 4) : 335-336.10 Terada Y, Inoshi ta S, Nakashima O, et a l. Lovastatin inhibits mesangial cell proliferation via p27 [ J ] . J Am Soc Nephrol, 1998, 9( 12) : 2235-2243. 11 林秀珍, 马德禄, 崔荣芬, 等. 大黄素、番泻甙及大黄多糖对培养大鼠肝细胞内游离钙浓度的影响[ J ] . 中国中西医结合杂志,1995, 15( 7) : 419- 421. 12 Short AD, Bian J, Ghosh TK, et a l. Intracellular Ca2 + pool content is linked to control of cell growth [ J ] . Proc Natl Acad Sci USA,1993, 90( 11) : 4986- 4990. 产品链接: 杜仲提取物 绿原酸 金银花提取物 苦杏仁苷 枇杷叶提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科罗索酸 上禾生物 专注植提 精于高纯 基于您对天然产物需求持续创新 |