HPLC法测定不同产地夏枯草中熊果酸的含量 |
发布时间:2010-10-11 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:3009 |
黄丽霞,贾晓斌,陈彦,赵呈雷,封亮,蔡垠(1.江苏省中医药研究院, 南京市210028;2.江苏大学药学院,镇江市212013) 摘要 目的:建立以高效液相色谱法测定夏枯草中熊果酸含量的方法,并检测不同产地夏枯草中熊果酸的含量。方法:色谱柱为ZorbaxSBC18(150mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液(pH7.6)=45∶55,检测波长为210nm,流速为1.0mL·min-1。结果:熊果酸进样量在0.1115~1.7840μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.9992);平均回收率为99.93%,RSD=0.77%(n=6)。不同产地夏枯草中熊果酸的含量在0.08%~0.18%之间。结论:不同产地夏枯草中熊果酸含量差异很大。本方法简便、准确、重现性好,可用于夏枯草的质量控制。 关键词 高效液相色谱法;夏枯草;熊果酸;含量测定;产地 夏枯草(SpicaPrunellae)为唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗,具有清火、明目、散结、消肿之功效[1]。其含有多种活性成分,主要有三萜类、甾体类、黄酮类、香豆素类等化合物。现代临床和药理研究表明,夏枯草具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等作用[2,3],临床可用于治疗瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛、甲状腺肿大等症。熊果酸是夏枯草中的有效成分,具有抗病毒性肝炎、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等多种生物活性[4]。夏枯草在全国各地均有生长,尤以江苏、浙江、安徽、河南等地为主要产区,虽然个别地区有夏枯草GAP种植基地,但全国范围内仍以野生入药为主。不同生长环境、不同加工方法可导致药材的质量存在差异。因此,笔者采用高效液相色谱(HPLC)法测定不同产地夏枯草中熊果酸的含量,为评价各地夏枯草药材的质量提供依据。 1 仪器与试药 1200型高效液相色谱仪,包括在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、恒温柱温箱、DAD检测器(美国Agilent公司);1200型化学工作站(美国Agilent公司);十万分之一电子天平(瑞士MettlerToledo公司);索氏提取器(四川蜀玻(集团)有限责任公司);数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110742-200516);乙腈(色谱纯,美国Tedia公司);水为纯净水,乙醚、石油醚、磷酸二氢钾等均为分析纯;夏枯草药材购自江苏、贵州、广西、安徽、湖南等地,均为2007年产,经南京中医药大学药学院生药学教研室吴德康教授鉴定为真品。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱:ZorbaxSBC18 (150mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-磷酸盐缓冲液(pH7.6)=45∶55;流速:1.0mL·min-1;检测波长:210nm;柱温:30℃。在此条件下,熊果酸与其相邻成分分离度较好(R>1.7)。色谱见图1。 2.2 对照品贮备液的制备 精密称取熊果酸对照品4.46mg,置于20mL量瓶中,用无水乙醇溶解并定容,配制成0.223mg·mL-1的对照品贮备液。 2.3 供试品溶液的制备 精密称取不同产地的夏枯草粗粉,置于索氏提取器中,加适量乙醚浸泡过夜,加热回流6h,回收溶剂,残渣用石油醚(60~90℃)浸泡2次,每次15mL,浸泡2min,倾出石油醚液,残渣挥干溶剂,用无水乙醇溶解并转移至10mL量瓶中,加无水乙醇至刻度,精密量取1mL至10mL量瓶中,以无水乙醇稀释至刻度,摇匀,0.45μm微孔滤膜过滤,即得不同产地的夏枯草供试品溶液。 2.4 阴性对照溶液的制备 取适量乙醚置于索氏提取器中,按“2.3”项下方法自“加热回流6h”起制备阴性对 照溶液。 2.5 线性关系考察 取上述对照品贮备液,分别吸取0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL,置于10mL量瓶中,以无水乙醇定容至刻度,得不同浓度的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样20μL,测 得峰面积积分值。以对照品的进样量(X)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程为Y=13077X—8.8793(r=0.9992)。结果表明,熊果酸进样量在0.1115~1.7840μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。 2.6 精密度试验 取“2.2”项下同一熊果酸对照品,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,测定峰面积。结果,RSD=0.39%,表明仪器精密度良好。 2.7 重现性试验 取同一产地(贵州)药材,按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果,RSD=1.09%,表明方法重现性良好。 2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液,在0、2、4、8、12、24h时间点分别进样分析。结果,熊果酸峰面积基本不变,RSD=1.26%,表明供试品溶液在24h内稳定。 2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一产地(贵州)样品约1g,共6份,分别精密加入相应含量的熊果酸对照品,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,计算加样回收率,结果见表1。 2.10 样品含量测定 取10个产地的夏枯草药材,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,计算含量,结果详见表2。 3 讨论 由表2可知,不同产地夏枯草药材中熊果酸含量的差异很大。在所测的10个产地的药材中,以四川产夏枯草中含量最高,江苏盱眙产夏枯草中含量最低。故临床在应用时应严格控制药材的质量,以确保药效。 熊果酸为五环三萜类成分,分子中仅存在一个双键,其无水乙醇溶液在205nm波长处有最大吸收,但在此波长下,甲醇末端吸收较严重,基线不够理想,故选择检测波长为210nm。笔者通过查阅文献[5,6],经预试验比较后,最终采用乙腈-磷酸盐缓冲液(pH7.6)=45∶55为流动相,既可较好地测定熊果酸含量,又能使其与相邻成分达到基线分离。本方法简便、准确、重现性好,可更好地用于夏枯草的质量控制。 参考文献 [1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2005:197. [2] 顾晓洁,钱士辉,李友宾,等.夏枯草的化学成分及药理作用研究进展[J].中国野生植物资源,2007,26(2):5. [3] 薛明,冯怡,徐德生.夏枯草化学成分及药理作用的研究概况[J].江苏中医药,2005,26(5):55. [4] 李开泉,陈武,熊筱娟,等.乌索酸的化学、药理及临床应用进展[J].中成药,2002,24(9):709. [5] 戚志华,王四旺,王剑波.高效液相色谱法测定陕西境内不同产地、不同生长期女贞子中2组分的含量[J].中国药房,2007,18(6):455. [6] 罗新根,蒋琳兰,赵树进.高效液相色谱法同时测定白花蛇舌草中2组分的含量[J].中国药房, 2004,15(3):175. 产品链接: 杜仲提取物 绿原酸 金银花提取物 苦杏仁苷 枇杷叶提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科罗索酸 上禾生物 专注植提 精于高纯 基于您对天然产物需求持续创新 |