杜仲叶提取物的体外抗氧化作用 |
发布时间:2010-10-09 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:3182 |
刘静 (陕西教育学院生命科学系,陕西西安710061) 摘要:通过测定杜仲叶提取物对02- 和·OH的清除率,对小鼠红细胞氧化溶血的影响和对各脏器MDA生成的抑制率,评价杜仲叶提取物的体外抗氧化作用。实验结果表明,杜仲叶提取物具有明显的体外抗氧化作用。 关键词:杜仲叶;体外抗氧化;自由基 杜仲(Eucommla ulmiodes Olives)为被子植物门杜仲科(Eucommiaceae)杜仲属落叶乔木,是一种名贵药材。《神农本草经》将其列为上品,它具有补中益气、坚筋骨、强志、安胎……久服轻身耐老之功效。长期以来,人们都以杜仲皮入药,近年来的研究表明 [1,2,3],杜仲叶与皮具有相似的化学成分和药理作用,可代皮供药用。为了开发利用这一天然资源,我们对杜仲叶的体外抗氧化作用进行了实验研究。 1 材料与方法 1.1 材料 杜仲叶:采自秦岭山区,提取液由陕西教育学院生命科学系生化实验室制备。 1.2 动物 1月龄的ICR小鼠,体重20±2克,雌雄兼用。由陕西省中医药研究院实验动物中心提供(陕医动字08—004号)。 1.3 实验方法 1.3.1 对02-的清除率的测定[4] 每支试管加入3mlTris—HC1缓冲液(pH8.2),0.1ml不同药液或溶媒,25℃ ±0.5℃水浴平衡20min后,加入0.3ml7mmo1.L 的邻苯三酚,准确反应4min,各加入lml lOmo1.L-1 HC1终止反应,420nm测A值,计算清除率。 1.3.2 对·OH清除率的测定[5] 用FeSO4+H2O2产生·OH,以·OH氧化水杨酸钠所得产物的吸光值表示·OH的多少,吸光值越大,·OH越多。3ml反应液中含0.15mmo1.L-1。FeSO4,6mmol-1.L H2O2,2mmo1.L-1 水杨酸钠及不同浓度的药物,最后加H202启动反应,37℃反应1h,测510nm吸光值,吸光值越低,清除·OH效果越好。 1.3.3 对小鼠红细胞氧化溶血的影响[6] 小鼠眼眶取血分离红细胞,生理盐水洗3次后制成0.5%悬液。取红细胞悬液lml,加不同浓度的杜仲叶提取液,最后加100mmo1.L H2O2混匀,37*℃温浴1h,用生理盐水稀释5倍,lO00g离心10rain,取上清液于415nm 比色测定,以对照组为100%溶血,计算溶血度。 1.3.4 丙二醛(MDA)含量的测定 组织匀浆制备:用引颈法处死小鼠,迅速取其肝、心组织,冰浴下匀浆,制成5%的悬液。 肝亚细胞制备:肝组织于冰浴下以0.25mo1.L 蔗糖缓冲液制成10%匀浆,l000g离心10min,沉淀用预冷的0.25mo1.L 蔗糖缓冲液洗2次,合并上清液,以10000g离心20rain,沉淀用0.25mo1.L 的蔗糖缓冲液洗2次,合并上清液,所得沉淀即为纯化的线粒体[7]。 MDA的测定[5]:取lml组织匀浆液或肝亚细胞悬液,加入不同浓度的杜仲叶提取物,再加入6mmo1.L-1。FeSO4100ul,最后加60mmo1.L-1H202 40ul。在37℃下,水浴1h后,加入15%TCA lml结束反应,再加入0.67%TBA lml,于沸水浴中显色15min,冷却后离心,测532nm吸光度,以吸光度表示MDA含量多少,吸光值越大,MDA含量越高。 2 结果与讨论 进行体外实验可以排除体内实验的复杂性,如药物在体内的分解、代谢、吸收、转化等,药物与体内物质如抗氧化酶、微量元素等的相互作用,药物有效成分的利用度等各种问题,从而能够更为直接地观察药物的治疗效果,为药物的体内实验提供实验依据,对于阐明药物的作用机制有一定帮助。 2.1 对02-的清除率 02-是活性氧的一种,是机体内寿命最长的自由基,通常作为自由基链式反应的引发剂,产生活性更强的自由基,在体内由过氧化物歧化酶清除。如果体内过氧化物歧化酶活力下降或02-产生过量都会给机体造成危害。本实验通过邻苯三酚自氧化产生02-,来观察杜仲叶提取物在体外对02-有无抑制或清除作用,结果如表1所示。 由表1结果显示,加药组的A420nm值均低于对照组,表明杜仲叶提取物可以清除02-或使02-的生成减少,当杜仲叶提取物的浓度达到8.00ug/ml时效果显著。 2.2 对·OH的清除率 ·OH是氧化性极强的氧化剂,不仅是膜脂质过氧化的罪魁祸首,它还一直被认为是引起DNA损伤的重要因素。本实验测定杜仲叶提取物在体外对·OH有无抑制作用,结果如表2 所示。 表2结果显示,杜仲叶提取物各剂量组的A510nm值均小于对照组,数据差异极显著,说明杜仲叶提取物对·OH有良好的清除作用,且有一定的量效关系。 2.3 杜仲叶提取物对小鼠红细胞溶血的影响 红细胞是机体运输O2和CO2的细胞,含有引发催化脂质过氧化作用的物质血红蛋白,膜上又含有大量不饱合脂肪酸,因此容易受到氧化损伤。本实验用H2O2诱导红细胞氧化溶 血来研究杜仲叶提取物对红细胞膜氧化损伤的抑制作用。结果如表3所示。 表3结果显示,正常的红细胞在体外温育过程中有轻微的溶血现象,这与报道结果一致[8]。模型组与正常组有极显著差异,说明H2O2可以诱导红细胞的氧化溶血;加药组低于模型组,差异显著或极显著,且呈一定的量效关系,说明杜仲叶提取物可以抑制红细胞的氧化溶血。 2.4 杜仲叶提取物对小鼠心、肝匀浆及肝线粒体脂质过氧化产物生成的影响 MDA为脂质过氧化产物,它可与含有游离氨基的蛋白质、磷脂酰乙醇胺及核酸等进行多次交联,连接成比原来大许多倍的大分子,致使膜蛋白变性,膜酶失活,膜受体失效,出现膜结构的破坏,膜流动性下降,膜脆性和通透性的增加,导致生物膜结构和功能的异常,影响机体的物质代谢,能量代谢和信息传递,从而危及正常的生命活动。其生成的多少可以反映出组织细胞的受损程度。在生物体内90%以上的氧分子在线粒体中被消耗,氧作为呼吸链的终电子受体参与产生ATP的氧化磷酸化反应,是维持生命的重要能量代谢过程,但是氧通过一系列化学反应生成有害的氧自由基,造成细胞损伤并导致疾病和衰老。实验证明线粒 体是细胞中产生活性氧的一个重要部位,CHANCE等[9] 证明在正常生理情况下约有2%的氧消耗于线粒体活性氧的产生,生成活性氧的前体是02和H2O2,它们是呼吸链底物端漏出的电子引起氧分子单电子还原生成的。本实验用FeSO4和H2O2产生·OH来诱导组织脂质过氧化,测定了杜仲叶提取物对小鼠心、肝匀浆及肝线粒体中MDA生成的影响,结果如表4、表5、表6所示。 表4、表5、表6显示,模型组与正常组相比,MDA的生成量增加,数据差异极显著,说明·OH可使小鼠心脏、肝脏及肝线粒体的脂质过氧化反应加速。加药组与模型组相比MDA的含量显著下降,数据差异显著或极显著,说明杜仲叶提取物可以有效抑制·OH所致的小鼠组织及肝亚细胞脂质过氧化的发生,保护细胞膜的完整性,从而保护组织免受损伤,而且抑制率随杜仲叶提取物浓度增加而提高。 [参考文献] [1]王景祥.杜仲叶与杜仲皮的成分比较中草药EJ].1987,18(3):11. [2]张康健.杜仲叶与皮有效成分含量的比较研究[J].西北林学院学报,1996,11(2):42. [3]宋丽青.杜仲叶与杜仲皮的药理试验[J].中草药,1986,17(2):15. [4]王书芳,王勤,潘静,等.吡咯啉氮氧自由基及衍生物抗大鼠不同组织脂质过氧化损伤[J].中国药理学通报,2001,17(4):424—427. [5]王建华,张民,甘璐,等.枸杞多糖一1对羟自由基所致小鼠肝线粒体损伤的作用[J].中国药学杂志,2001,36(10):669. [6]田京伟,杨建雄.白藜芦醇苷的体外抗氧化活性[J].中草药,2001,32(10):918—920. [7]曹炜,尉亚辉,杨建雄.蜂胶对氧自由基和四氧嘧啶致小鼠肝脏损伤的保护作用[J].中草药,2001,32(11):1013—1015. [8]冯立明,潘华珍,闵福宝,等.麦芽醇对红细胞氧化损伤的保护作用[J].中国药理学通报,1990,11(6):26. [9]CHANCE B,SIES H,BOVERIS A.Hydropemxide metabolism in mammalian organs[J].Physiological Reviews,1979,59(3):527—605.
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