高效液相色谱同时测定红直獐牙菜5 种有效成分的含量 |
发布时间:2010-09-16 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2173 |
赵旭升, 林鹏程* ( 青海民族学院药学系, 青海西宁810007) 摘要 对红直獐牙菜中番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷采用ZORBAX SB- C18( 250 mm×4 .6 mm,5 μm) 色谱柱, 以流动相甲醇和水( 含0 .04 %磷酸) 的比例在0 ~45 min 内由20∶80 至45∶55 线性梯度洗脱, 检测波长254 nm, 柱温35 ℃, 流速1 ml/ min。结果显示,5 种化学成分均达到基线分离, 各成分都有较宽的线性范围和良好的线性关系。可见, 该方法测定中药材成份含量快速, 结果准确、可靠。 关键词 反相高效液相色谱; 有效成分; 龙胆科; 红直獐牙菜 青藏高原龙胆科( Gentianaceae) 植物是藏医用来治疗肝、胆疾病的药物[ 1] 。其主要化学成分有番木鳖酸( Loganic acid) 、獐牙菜苦苷( Swertiamarin) 、龙胆苦苷( Gentiopicroside) 、芒果苷( Mangiferin) 、当药醇苷( Swertianolin) 等[ 2] 。现代药理学研究表明, 番木鳖酸具有一定的抗炎活性, 对角叉菜胶引起的小鼠脚肿胀和十四烷佛波醇乙脂引起的小鼠耳肿胀抑制率达44 .4 %[ 3] ; 獐牙菜苦苷具有提高皮肤机能、促进毛发生长、抑制中枢神经、镇痛和抗炎等作用[ 4] ; 龙胆苦苷具有促进胃液分泌、抗原虫和抗炎作用[ 5] ; 芒果苷具有抑制中枢神经、抗炎、抗结核、利胆等疗效[ 4] ; 当药醇苷具有降血糖、保 肝、抗菌、抗疟疾、治疗心血管疾病、抗氧化性等作用[ 6] 。对龙胆科植物中龙胆苦苷的测定方法主要有薄层扫描和高效液相色谱法[ 7 - 8] , 但关于龙胆科植物中番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷和当药醇苷同时测定的方法未见报道。笔者建立了用反相高效液相色谱法同时测定上述5 种化学成分含量的方法, 对评价药材质量、充分利用药物资源有重 要意义。 1 材料与方法 1 .1 材料红 直獐牙菜( Swerti a erythrotict a Maxim.) ,2005 年8 月采于青海省互助北山林场。样品由中国科学院西北高原生物研究所胡凤祖副研究员鉴定。样品阴干后粉碎过80 目 筛, 冷藏保存。 1 .2 仪器与试剂Agilent1100 高效液相色谱仪, 配置为手动进样器、在线脱气机、高压二元梯度泵、恒温柱温箱、DAD 检测器、Agilent1100 色谱工作站、ZORBAX SB-C18( 250 mm×4 .6mm,5 μm) 色谱柱;KQ3200 超声波清洗器, 昆仑市超生仪器有限公司;SZ- 97 自动三重纯水蒸馏器, 上海亚荣生化仪器厂。甲醇为高效液相色谱专用试剂, 山东禹王实业有限公司禹城化工厂; 水为自制三重蒸馏水; 磷酸为AR 级, 北京红星化工厂獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷对照品购于中国生物制品鉴定检验所; 番木鳖酸对照品由青海普兰特藏药研究所孙洪发研究员提供; 当药醇苷对照品由中国科学院西北高原生物研究所胡凤祖副研究员提供。经归一化测试, 以上对照品纯度均大于98 .5% 。 1 .3 对照品储备液的配制精确称取对照品番木鳖酸2 .50mg 、龙胆苦苷1 .27 mg 、獐牙菜苦苷2 .90 mg 、芒果苷2 .40 mg 和当药醇苷2 .2 mg 分别置1 ml 容量瓶中, 以甲醇溶解并定容,配制成相应浓度的对照品储备液, 使用时稀释成所需浓度。 1 .4 样品溶液的制备分别精确称取粉碎至80 目的待测样品, 每份0 .5 g , 分别加入15 ml 甲醇室温超声提取40 min, 定容于25 ml 容量瓶, 过0 .45 μm 滤膜, 在选定色谱条件下测定峰面积。 2 结果与分析 2 .1 色谱条件的选择色 谱柱为ZORBAX SB-C18( 250 mm×4 .6 mm,5 μm) , 流动相为甲醇和水( 含0 .04% 磷酸) 在0 ~45min 内由20∶80 至45∶55 梯度洗脱, 流速1 ml / min, 检测波长254 nm, 柱温35 ℃, 在该色谱条件下5 种有效成分均达到基线分离。图1 表明, 番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷的保留时间分别为11 .11 、13 .54 、15 .88 、18 .77 、41 .63 min。 2 .2 线性关系的考察精确量取番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷5 种对照品储备液, 以甲醇配制浓度分别为: 番木鳖酸0 .125 、0 .050 、0 .025 、0 .016 7 、0 .012 5 、0 .010 mg/ ml ; 獐牙菜苦苷0 .580 、0 .290 、0 .145 、0 .058 、0 .029 、0 .019 mg/ ml ; 龙胆苦苷0 .625 、0 .245 、0 .122 、0 .024 5 、0 .012 2 、0 .098 mg/ ml ; 芒果苷0 .600 、0 .024 、0 .120 、0 .024 、0 .004 8 、0 .001 2 mg/ ml ; 当药醇苷0 .008 8 、0 .013 2 、0 .017 6 、0 .022 、0 .026 4 、0 .035 2 mg/ ml 的混合对照品标液系列溶液。每次进样5 μl , 以峰面积的积分值定量。试验发现, 番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷的回归方程分别为A=609 .13 X+ 0 .93 、A= 667 .07 X + 22 .48 、A= 1 007 .73 X + 33 .40 、A= 3 247 .87 X- 7 .20 、A= 4 714 .04 X - 63 .56 ; 相关系数分别为0 .999 9 、0 .999 8 、0 .999 9 、1 .000 0 、0 .999 3 ; 线性范围分别为0 .05 ~0 .625 、0 .009 5 ~2 .9 、0 .048 6 ~2 .56 、0 .005 6 ~2 .8 、0 .044 ~0 .154 μg 。 2 .3 检测限的确定在“2.1”色谱条件下, 当信噪比S/ N = 3 时, 对各组分最低检测限进行测定。结果表明, 番木鳖酸、 獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷的最低检测限分别 为1 .25 、0 .56 、0 .50 、0 .48 、0 .65 ng 。 2 .4 精密度试验取 含0 .025 mg/ ml 番木鳖酸、0 .058 mg/ ml獐牙菜苦苷、0 .024 5 mg/ ml 龙胆苦苷、0 .024 mg/ ml 芒果苷、0 .022 mg/ ml 当药醇苷混合对照品溶液, 在“2 .1”色谱条件下测定色谱峰的峰面积, 计算得RSD 分别为0 .72% 、0 .90% 、0 .69 % 、0 .93% 、1 .12 %( n = 6) , 表明仪器精密度良好。 2 .5 重复性试验精 确称取6 份0 .500 g 红直獐牙菜样品,按“1.4”项下方法操作, 在“2 .1”色谱条件下测定番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷的含量, 计算得RSD分别为2 .4 % 、1 .4% 、2 .0% 、2 .9 % 、3 .1%( n =6) , 表明方法重复性良好。 2 .6 稳 定性试验精 确称取红直獐牙菜样品0 .500 g , 按“1.4”项下方法操作, 分别在0 、2 、4 、6 、8 h 时进样, 测定番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷的峰面积, 计算得其RSD 分别为1 .4% 、1 .8% 、1 .0% 、2 .1% 、2 .4%( n = 5) 。这表明样品溶液在8 h 内稳定。 2 .7 回收试验精确称取3 份已测知含量的红直獐牙菜样品各0 .05 g , 添加各对照品溶液适量( 0 .80 ml 0 .25 mg/ ml 番木鳖酸溶液、0 .70 ml 0 .19 mg/ ml 獐牙菜苦苷溶液、0 .60 ml 0 .245 mg/ ml 龙胆苦苷溶液、0 .20 ml 0 .14 mg/ ml 芒果苷溶液、0 .10 ml 0 .022 mg/ ml 当药醇苷溶液) , 按“1.4”项下方法操作,测得番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷的平均回收率( n = 3) 分别为102 % 、97 .7% 、99 .5% 、103% 、101% ; RSD 分别为4 .4% 、4 .3% 、3 .5 % 、1 .1% 、4 .1 % 。 2 .8 红直獐牙菜中有效成分的测定取“1.4”项下制备的样品溶液按“2.1”色谱条件进行分析, 经DAD 检测器检测以上5 种待测组分的峰纯度, 且待其紫外光谱与对照品一致后, 按外标法以峰面积积分值计算, 得5 种有效成分的百分含量( 每个样品重复进样3 次, 取平均值) 为番木鳖酸0 .522 % 、龙胆苦苷1 .52 % 、獐牙菜苦苷0 .214 % 、芒果苷0 .023 1 % 、当药醇苷0 .138% 。 3 讨论 3 .1 检测波长的确定对照品溶液进样后, 利用DAD 检测器在200 ~400 nm 扫描其吸收光谱, 对照品在254 nm 波长处有较高的吸收峰, 选择该波长为检测波长。 3 .2 提 取方法确定参 照文献[ 9] , 比较了不同提取方法( 超声和热回流) 、提取时间( 15 、30 、45 、60 min) 对提取率的影响, 结果发现, 超声提取法优于热回流提取法, 且超声提取30min 即可将有效成分提取完全, 故该试验采用超声提取法。 3 .3 流动相的选择番 木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药酵苷的色谱峰易拖尾。试验发现, 在水中加入0 .04 %( V/ V) 磷酸时可改善番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷的峰形。故选择甲醇和含0 .04% 磷酸的水作流动相。 4 结论 该试验建立的高效液相色谱法具有简便、快速, 结果准确、可靠等优点, 对评价药材质量、充分利用药物资源有重要意义。 参考文献 [1] 纪兰菊, 孙洪发, 丁经业. 青藏高原四种龙胆植物化学成分初步研究[ C] / / 中国科学院西北高原生物研究所. 高原生物学集刊,1992 . 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