大黄素对卵巢癌HO一8910PM细胞中PRL.3和NAG一1表达的影响 |
发布时间:2010-09-15 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2510 |
何太平1,莫丽儿2,梁念慈1 (1广东医学院生物化学与分子生物学研究所,广东湛江524023; 2广东天然药物研究与开发重点实验室) 【摘要】目的研究大黄素对人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞中促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)和非类固醇抗炎药物激活基因(NAG.1)表达的影响。方法采用Weslem blot法检测大黄素对HO-8910PM细胞中PRL-3和NAG.1蛋白表达的影响,荧光定量实时PCR分析大黄素对HO-8910PM细胞中PRL-3和NAG-1 mRNA表达的影响。结果大黄素能明显下调HO-8910PM细胞中PRL-3的表达,强烈上调NAG·1表达。结论大黄素影响高转移卵巢癌细胞转移能力可能与PRL-3和NAG一1表达有关。 【关键词】大黄素;卵巢肿瘤;聚合酶链反应 大黄素在体外具有明显的抗肿瘤作用,能诱导多种癌细胞发生凋亡作用。2007年1月一2008年3月,我们采用免疫印迹和实时荧光定量PCR方法,研究大黄素对HO一8910PM细胞中促肝细胞再生磷酸酶(PRL)和非类固醇抗炎药物激活基因(NAG—1)蛋白表达的影响,探讨大黄素影响高转移卵巢癌细胞转移能力的作用机制。 1材料与方法 1.1材料人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞。细胞在含10%小牛血清,100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI 1640完全培养基中,37℃、5%CO2饱和湿度孵箱培养。细胞经消化传代,取对数生长期的细胞进行培养。 1.2药品与试剂超级小牛血清;RPMI 1640培养基;4×上样缓冲液(125 mmol/Tris—HCl,pH=6.8,4%SDS,10%13-巯基乙醇,20%甘油,0.04%溴酚蓝);PRL-3小鼠单克隆抗体、NAG一1兔多克隆抗体;B-actin兔IgG多抗;辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记抗兔IgG。大黄素,实验前用DMS0溶解,培养基稀释,DMSO终浓度为 0.1%(实验证明该浓度对细胞无影响)。 1.3方法 1.3.1 Western blot法取对数生长期的HO一8910PM细胞,稀释成1×100/ml,接种于50 InlTl的培养皿中培养,每皿5 IIII。待细胞贴壁后,分别用0.1%DMSO和10、20、40 ktmol/L的大黄素处理HO-8910PM细胞24 h,收集细胞,PBS洗涤2次,加人预冷的细胞裂解液100斗l,用细胞刮将细胞刮下,并转移至预冷的1.5 ml离心管中,置于碎冰上冰育20 min后,于4℃,12 000 g离心15 rain。BCA法测定上清液蛋白质含量。蛋白样品和4 X上样缓冲液按3:1的比例混合,100℃水中煮沸5 rain使蛋白质变性。SDS.PAGE电泳后电转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭后加入第1抗体于室温孵育2 h,用TBS缓冲液洗涤3次,每次10 rain,加入第2抗体于室温孵育2 h,再用TBS缓冲液洗涤3次,每次10rain,加入发光试剂显色,以actin作内参,用图像分析软件Scion Image进行光密度积分值分析。 1.3.2实时荧光定量PCR法参照实时荧光定量PCR引物设计要求,设计合成PRL一3:5-CACGCTCAGCACCTTCA,IrrG-3’.5’一GTTCCATCACCITCTGAC—CGAC-3’;NAG一1.5’一TGACrrI二TTAGCCAAAGACTGCC一3’,5’一Q气ACCTTGAGCCCATTCCACA-3’;13-aetin:5’一CCTGTACGCCAACACAGTGC.3 7.5’-ATACTCCTGCTr.GCTGATCC-3 7。培养H0-8910PIVI细胞,分别用0.1%DMSO和40 lajnol/L的大黄素处理HO.8910PM细胞24 h,Trizol试剂提取总RNA,变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。按反转录试剂盒操作流程行反转录实验。配实时PCR反应体系,置于Rotor—Cene 3000 ReahimePCR仪上进行PCR反应,反应条件如下:①PRL-3:95t2,5 min;35个PCR循环(95℃,10 s;60℃,15 s;72 qc,20 s;83℃收集荧光,5 s);②NAC一1:95℃,5 rain;35个PCIt循环(95℃,10 s;60℃,15 s;72℃,20 s;85℃收集荧光,5 s);③B.actin:95 oC,5rain;35个PCR循环(95 oC,10 s;57 oC,15 s;72 oC,20s;85.5℃收集荧光,5 s)。为了建立PCIt产物的熔解曲线,扩增反应结束后继续从72 cC缓慢加热到99℃(每5 s升高1℃)。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线,求出样品中PRL-3、NAG.1和13.actin的浓度,再用13一actin校正,算出样品中PRL-3和NAC.1的相对含量。 1.3.3统计学方法采用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析,所有数据以孑±s表示。检验水准a=0.05。 2结果 2.1 Western blot法检测结果大黄素能够明显抑制PRL-3蛋白的表达,10、20、40 i山mol/L的大黄素处理组中PRL-3蛋白表达水平分别是对照组的(0.85±0.07)、(0.59±0.06)、(0.22±0.05)倍(P均<0.05),见图1;大黄素还强烈上调NAG一1蛋白表达,10、20、40 I上mol/L的大黄素处理组中NAG一1蛋白表达水平分别是对照组的(2.36±0.19)、(7.34±0.35)、(7.90±o.43)倍(P均<005),见图2。 2.2实时荧光定量PCR法分析结果大黄素能够抑制PRL一3 mRNA的表达,40 i上mol/L的大黄素处理组中PRL-3 mRNA表达水平是对照组的(O.35±0.01)倍(P<0.05);强烈上调NAG一1 mRNA表达,40 txmol/L的大黄素处理组中NAG一1 mI{NA表达水平是对照组的(10.06±0.86)倍(P<0.05)。 3讨论 PRL.3是在肿瘤转移过程中起至关重要作用的蛋白酪氨酸磷酸酶。Sager等[l]提出PRL-3是抗肿瘤转移的重要靶标之一。Ahn等[2]通过高通量筛选方法找到先导化合物罗丹宁,合成两个能抑制PRL一3酶活性的罗丹宁衍生物,并初步评价它们抗肿瘤转移效果。本文结果显示大黄素能抑制PRL-3表达,初步证实大黄素在体外能抑制高转移卵巢癌细胞的转移相关能力与PRL-3表达有关,但其影响PRL一3表达的作用机制还不清楚,是否抑制PRL一3酶活性也有待进一步证实。NAG.1是TCF一13超家族的成员之一,又名巨噬细胞抑制因子一l、胎盘转化生长因子一13、前列腺衍生因子、生长分化因子15和胎盘骨形态发生蛋白。研究表明NAG-l高表达具有抗肿瘤作用,NAG-1能抑制多种癌细胞株的生长增殖。进一步的研究发现,NAG—l在结肠癌和恶性胶质瘤细胞中过表达可抑制裸鼠移植瘤的形成口J。新近NAG一1被发现与肿瘤凋亡有密切的关系,过表达NAG.1能引起多种肿瘤细胞如结直肠癌、肺癌、口腔癌、胃癌细胞和大肠癌等癌细胞的凋亡。Liu等H1研究发现NAG一1能激活前列腺癌细胞DU一145细胞caspase一3表达而诱导凋亡。Shim等口。通过siRNA抑制TPA诱导NAG.1表达,可阻断TPA诱导的LNCaP细胞凋亡。NAG—l促肿瘤细胞凋亡作用在持续表达NAG一1的转基因小鼠体内实验中得到了验证旧o。由于NAG一1是TGF.13超家族的成员之一,研究表明TGF一13信号通路与肿瘤细胞的转移能力密切相关,“u等研究还发现NAG.1在体外能减少肿瘤细胞一细胞外基质和肿瘤细胞一肿瘤细胞之间的黏附能力,并促进肿瘤细胞凋亡。本研究发现大黄素能上调NAG-1在该细胞中的表达,从而可解释大黄素诱导NAG一1高表达能抑制卵巢癌细胞转移能力,但具体的作用机制有待更深入的研究。总之,大黄素抑制高转移卵巢癌转移相关能力与PRL.3和NAG一1的表达相关。 [参考文献】 [1]Sager JA,Benvenuti S,Bardelli A.PRL-3:8 pht8phatase for me—tastasis[J]?Cancer Bio Ther,2004,3(10):952-953. [2]Alan JH,Kim SJ,Park WS,et a1.Synthesis and biological evalua—tion of rhodanine derivatives as PRL-3 inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett,2006,16(1 1):2996-2999. [3]Albertoni M,Shaw PH,Nozaki M,et a1.Anoxia induces macrophage inhibitory cytokine-1(MIC一1)in glioblastoma cells independ—ently of r63 and HIF-1[J].Oncogene,2002,21(27):4212—4219. [4]Liu T,Bauskin AR,Zaunders J,et a1.Macrophage inhibitory cyto—kine 1 reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancercells[J].Cancer Res,2003,63(16):5034-5040. [5]Shim M,Eling TE.Protein kinase C·dependent regulation of NAG—l/placental bone morphogenic protein/MIC·1 expression in LNCaP prostate eaceinoma cells[J].J Biol Chem,2005,280(19):18636·18642. [6]Back SJ,Okazaki R,l ee SH,et a1.Nonsteroidal anti-inflammatory drug activated gene一1 overexpression in transgenicmice suppresses intestinal neoplasia[J].Gastroenterology,2006,131(5):1553-1560. 产品链接: 杜仲提取物 绿原酸 金银花提取物 苦杏仁苷 枇杷叶提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科罗索酸 上禾生物 专注植提 精于高纯 基于您对天然产物需求持续创新 |