超声波辅助法提取山茱萸发酵产物中的熊果酸 |
发布时间:2010-09-04 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:4707 |
胥佰涛1 , 何国庆1 , 李心泓2 , 于海宁3 , 沈生荣1 (1 . 浙江大学生物系统工程与食品科学学院食品科学与营养系, 浙江杭州310029 ; 2 . 杭州市药品检验所,浙江杭州310017 ;3 . 浙江工业大学药学院,浙江杭州310032 ) 摘 要:采用超声波辅助法提取山茱萸发酵产物中的熊果酸,以HPLC 法测定熊果酸含量,并研究熊果酸提取的最佳工艺条件.在30 ℃ 下,酵母接种量和原料质量比为3 ∶ 80 ,摇床转速为150 r·min- 1 时发酵效果好,发酵时间短;在酒精浓度85% ,温度50 ℃ ,超声功率100 W ,时间30 min 的条件下提取效果最好,熊果酸得率为0.2512% . 关 键 词: 山茱萸; 熊果酸; 发酵; 提取 山茱萸( Cornus o f f icinalis Sieb . etZucc) 属山茱萸系山茱萸科植物,是一种重要的野生资源.其果肉味酸、涩,微温,归肝肾经,有补益肝肾、涩精固脱的功效, 是中医临床常用的传统抗衰老药物之一, 主要功能成分为环烯醚萜类、皂苷、多糖、熊果酸、齐墩果酸、鞣质等[ 2] . 熊果酸( ursolie acid ,UA) ,是一种弱极性的五环三萜酸,其分子式为C30 H48 O3 (图1)[3 ] ,分子量为456.68 ,溶点285 ~ 287 ℃ ,易溶于二氧六环、吡啶,可溶于甲醇、乙醇、丁醇,略溶于丙酮,微溶于苯、氯仿、乙醚,不溶于水和石油醚.研究表明,熊果酸具有较高的生物学活性,包括抗癌、对肝损伤的保护、抗菌消炎和抗病毒等作用[4 ] .熊果酸具有较高的医用价值和保健功能,有广阔的市场前景,所以熊果酸的提取越来越受到广大科研学者的关注.
山茱萸中熊果酸的提取方法有多种,如索氏提取法、超声波提取法、乙醇回流提取法、超临界流体萃取法( SFE) 等.其中超声波提取法是利用超声波强大的空化作用使细胞壁破碎,强化传质,能显著提高熊果酸的提取效率.在原料中加入酵母菌,利用其酵解糖分的特点[5 ] ,分解山茱萸中的糖类,充分消除影响提取过程及效率的杂质.由于熊果酸属于萜类,不会因酵母发酵而影响得率和性质.降低山茱萸中的糖分,不但可以简化提取工艺,而且还可以提高粗提物中熊果酸的含量.迄今为止,有关酵母除糖结合超声波辅助提取技术应用于山茱萸中熊果酸提取尚未有文献报道. 1 材料与方法 1.1 材 料 山茱萸干燥果实产于浙江省临安市,由杭州天目生物科技有限公司提供.酿酒酵母( Saccharomyces cerev isiae ) , 由安琪酵母股份有限公司生产;熊果酸对照品购于中国药品生物制品鉴定所;甲醇为国产色谱纯,其余均为国产分析纯. 1.2 仪 器 KYC100B 型摇床(上海福玛实验设备有限公司) ;WYT 型糖量计(福建省泉州市万达实验仪器设备有限公司) ;KQ2200DB 型数控超声发生器(江苏省苏州市昆山市(县)超声仪器有限公司) ;岛津LC‐20A 型高效液相色谱仪(日本岛津公司) ;DZX‐6090 真空干燥箱(上海福玛实验设备有限公司) . 1.3 方 法 1.3.1 山茱萸提取工艺流程 山茱萸浆(山茱萸干粉+ 水) 发酵除糖加酒精超声提取过滤(弃去滤渣) 浓缩减压干燥初制品. 1.3.2 材料预处理 1.3.2.1 山茱萸发酵. 称取20 g 粉碎过的山茱萸干燥果实,置于三角瓶中,加入40 mL 水,搅匀,沸水浴加热. 干酵母活化:按设定条件,称取一定量干酵母,加入10 倍质量的水,40 ℃ 加热15 min ,转移至30 ℃ 的水浴锅中,待酵母液体冷却,转入三角瓶中,用牛皮纸封闭瓶口,置于摇床上,在设定条件下发酵. 1.3.2.2 发酵液糖分含量测定. 每隔12 h 用糖量计测量发酵液的糖度,记录发酵液糖度的变化. 1.3.2.3 发酵条件的选择. 本实验对发酵温度、酵母接种量、摇床转速进行单因素探索,分别考察3 个因素对原材料最终糖度和发酵速度的影响. 1.3.3 山茱萸中熊果酸提取方法 发酵完毕后,发酵液加入800 mL 不同浓度的酒精,置于超声发生器中,控制提取温度、超声波功率和提取时间,提取液过滤后定容于1000 mL 的容量瓶中. 1.3.4 提取液中熊果酸含量测定 1.3.4.1 色谱柱条件. 色谱柱Hypersil C18 (25cm × 4.6 mm ,粒径5 μm) ;流动相:甲醇‐水‐磷酸( 90 ∶ 10 ∶ 0.1 ) ;检测波长215 nm ,流速1.2mL·min- 1 ;柱温:室温.熊果酸对照品和山茱萸的HPLC 图谱见图2 ,添加回收率为94.2% . 1.3.4.2 对照品溶液制备. 精密称取干燥至恒重的熊果酸对照品2 mg ,用色谱纯甲醇溶解,溶液中熊果酸最终浓度为1 mg·mL -1 ,以微孔膜过滤,置于冰箱内冷藏保存,待用. 1.3.4.3 样品液制备.取1 mL 定容后的提取液,用色谱纯甲醇稀释至10 mL ,以微孔膜过滤,作为供试品溶液. 1.3.5 正交试验方案设计 在预备实验的基础上选取对熊果酸浸提率影响较大的4个因素进行正交试验:酒精浓度,超声波提取温度,超声波功率,超声波提取时间. 1.4 熊果酸得率计算 X = ( A样× C标× V ) ÷ ( A标× M原材料) × 100% ,式中A样为初制品峰面积;A标为对照品峰面积;C标为标准品浓度;V 为初制品溶解后溶液体积;M原材料为山茱萸干粉质量;X 为熊果酸得率/ % . 1.5 数据处理 本实验数据用Origin pro 7.5 版处理,实验重复3 次. 2 结果与讨论 2.1 发酵对山茱萸浆糖度的影响 接种酵母于山茱萸浆中,在酵母最适生长条件下进行发酵.发酵前山茱萸浆的糖度为20% .由图3 可知,对照组糖度随发酵时间变化不显著,而接种组的山茱萸浆糖度从第2 d 开始变化显著,到第3 d 变化极显著,第4 d 到第6 d 其变化维持在较高水平,随后变化显著性明显减弱,第8 、9 两天相比糖度变化无显著性,维持在8% .可见通过发酵能明显降低山茱萸浆的糖度. 2.2 发酵条件的选择 发酵条件的选择主要通过考察温度、接种量和摇床转速3个因素对发酵速度(用1/ T 表示,T 代表发酵天数)和发酵液最终糖度2 个指标的影响来实现.试验结果表明,不同发酵处理最终糖度均介于7% ~8% 之间,变化不明显. 2.2.1 发酵温度的选择 控制摇床转速150 r·min-1 ,接种量3 ∶ 80 ,比较摇床温度在20 、25 、30 和35 ℃ 下的发酵速度. 温度是影响发酵的主要因素之一,根据发酵第一定律[6 ] ,在某一温度范围内,发酵速度
和温度成正比,每增加10 ℃ ,发酵速度将增加1倍.当温度超过酵母生长最适宜温度时,高温对酵母的生长会产生抑制作用.由图4 可知,发酵速度随着摇床温度上升逐渐提高,到30 ℃ 时达到最高,温度再继续升高到35 ℃ 时,发酵速率有所降低.可见当摇床温度设为30 ℃ 时发酵温度接近酵母生长最适温度,发酵速率最快. 2.2.2 接种量的选择 控制发酵温度30℃ ,摇床转速150 r·min- 1 ,考察酵母接种量对发酵时间的影响. 接种量是影响酵母发酵速度的因素之一.酵母生长有4 个时期,即迟滞期、对数期、稳定期和衰老期,其中迟滞期糖分分解速率比较低,稳定期最高.而接种量的多少直接影响到酵母生长迟滞期的长短,接种量越多迟滞期越短,进入稳定期所用时间越短,达到糖分最大分解速率所用时间就越短.由图5 可知,发酵速率随着接种量的增加而增加,但是增加的趋势逐渐减小,当接种量为3 ∶ 80 和4 ∶ 80 时,发酵速率差别已经不明显.综合考虑时间和成本2 个因素,选择生产用量为3 ∶ 80 . 2.2.3 摇床转速的选择 控制发酵温度30℃ ,接种量3 ∶ 80 ,考察摇床转速对发酵时间的影响. 摇床转速也是影响发酵的重要因素之一.摇床摇动对发酵的有利影响主要有2个方面: 其一是通过摇床摇动能够使发酵液中氧气含量升高,有利于酵母代谢,加速糖分降解;其二是通过摇床摇动能够使酵母充分与发酵液混合,使发酵更加充分.但并非转速越高发酵速率越高,在发酵液氧气含量充足和酵母、发酵液混合充分的条件下,酵母已经达到最适生长状态,增加转速,发酵速率将不会提高.由图6 可知,发酵速率随着摇床转速增加而增加,但是增加的趋势趋于平缓.当转速从150 r·min- 1 增加到170 r·min- 1 时,发酵速率的增加已不明显.可见,转速控制在150 r·min- 1 最合适. 2.3 熊果酸提取工艺参数的确定 2.3.1 正交因素水平表设计 选择酒精浓度( A ) 、超声波提取温度( B) 、超声波功率( C)和超声波提取时间( D)4 个因素,利用4 因素3水平正交试验分析上述4 种因素对山茱萸中熊果酸提取效果的影响(表1) . 2.3.2 正交试验结果 在单因素试验基础上,设计L9 ( 34 ) 正交试验,正交试验结果见表2 . 由表2 可知,超声提取温度和超声功率的极差值较大,两因素对熊果酸的提取影响比较大,而酒精浓度和提取时间极差值相对较小,对熊果酸提取影响不明显.各因素对熊果酸提取影响的大小次序为:B ( 超声波提取温度) > C(超声功率) > A ( 酒精浓度) > D(超声波提取 时间) .最佳提取方案为:A2 B3 C3 D3 ,即酒精浓度85% ,提取温度50 ℃ ,超声率100 W ,超声时间30 min .追加试验结果表明,在此条件下熊果酸的浸出率为0.2512% . 2.4 熊果酸得率及分析 通过HPLC 法测定,计算出在最优工艺条件下熊果酸得率为0.2512% .该工艺的熊果酸得率明显高于其他方法,如索氏提取法提取率1.82 mg·g - 1 [ 7 ] (得率为0.182% ) ,超声波提取法提取率1.84 mg·g - 1 [ 7 ] (得率为0.184% ) ,乙醇回流提取法提取率2.2 mg·g - 1 [8 ] ( 得率为0.22% ) .该工艺之所以有高的熊果酸得率,主要有2 个方面的原因:一是通过发酵预处理酵母代谢掉了原料中大量糖分,有助于熊果酸的溶出;二是合适条件下的超声波处理使植物细胞最大程度的破碎,使熊果酸能最大程度的和提取剂接触,降低了熊果酸溶出的阻力. 3 结 论 3.1 山茱萸中熊果酸的最佳提取工艺及熊果酸得率:发酵参数为发酵温度30 ℃ ,酵母菌接种量和原料比值3 ∶ 80 ,摇床转速150 r ·min- 1 ,时间5 d .超声波提取参数为酒精浓度85% ,提取温度50 ℃ ,超声功率100 W ,提取时间30 min .熊果酸得率为0.2512% . 3.2 酵母发酵法除糖是利用酵母菌能对糖及其衍生物降解,在合适的工艺参数下,该方法能显著降低山茱萸的糖度而不影响熊果酸含量. 3.3 超声波辅助提取法能够提高提取率的主要原因是超声波产生的空化效应[8 ] ,能有效破碎细胞壁,增大细胞的通透性,强化传质,从而提高提取效率.超声波法提取熊果酸,在合适的工艺参数下提取时间短、提取温度较低、收率高、快捷、简便易行. 3.4 超声波辅助发酵法提取熊果酸工艺能显著提高熊果酸得率,降低提取过程中的处理难度,方法简便易行,为熊果酸提取提出了新思路,也为山茱萸综合利用奠定了基础. References : [ 1 ] DAI Jian‐zi , ZHANG Zhi‐hao , TANG Lei , et al . ( 戴建子, 张志豪, 唐蕾,等) .Progress in research of chemical component and pharmacology of Cornuso f f icinalis [ J] . China Pharmaceuticals ( 中国药业) ,2006 , 15 : 74‐75 . (in Chinese) [ 2 ] ZHOU Jing‐hua , LI Chun‐sheng , LI Dian‐dong ( 周京华,李春生,李电东) . Progress in research of the activechemical components of Cornus o f f icinalis [ J] .Chinese Journal of New Drugs ( 中国新药杂志) , 2001 ,10(11) : 808‐812 . (in Chinese) [ 3 ] Rajendrasozhan S , Periyaswamy V , Kodukkur V .Protective effect of ursolic acid on ethanol‐mediated experimental liver damage in rats [ J] . Life Sciences ,2006 , 78 : 713‐718 . [ 4 ] XIONG Bin , LEI Zhi‐yong , CHEN Hong ( 熊斌, 雷志勇, 陈虹) . Progress in research of pharmacology of ursolic acid [ J] . Foreign Medical Sciences Section on Pharmacy( 国外医学药学分册) , 2004 , 31 ( 3 ) : 133‐136 . (in Chinese) [ 5 ] 陈思妘, 萧熙佩. 酵母生物化学[ M] . 济南: 山东科学技术出版社, 1990 : 34‐36 . [ 6 ] WANG Su‐hui , LI Xia ( 王苏辉, 李霞) . Thetechnological conditions of fermentation and reproduction of wine yeast [ J] . Liquor‐Making Science& Technology ( 酿酒科技) , 1999 , 96 ( 6 ) : 29‐30 . ( in Chinese) [ 7 ] ZHAO Yu‐chong , LI Jian‐jun , LIU Guo‐ji , et al .( 赵玉丛, 李建军, 刘国际,等) . Extraction of ursolic acid from Cornus o f f icinalis and content determination[ J] . Journal of Zhengzhou University ( 郑州大学学报) ,2005 , 3 : 78‐81 . (in Chinese) [ 8 ] YANG Zhi‐kun , WANG Shi‐ming ( 杨志坤, 王世明) .Extraction of ursolic acid from Cornus O f f icinalis [ J] .Journal of Heilongjiang Cereals and Oils Science and Technology( 黑龙江粮油科技) , 1999 ( 4 ) : 52‐52 . ( in Chinese) [ 9 ] GUO Xiao‐wu (郭孝武) . A method of extract chemical components from Chinese herbs with ultrasound [ J] .Natural Product Research and Development( 天然产物研究与开发) , 1999 , l ( 3) : 37‐40 . (in Chinese) 产品链接: 杜仲提取物 绿原酸 金银花提取物 苦杏仁苷 枇杷叶提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科罗索酸 上禾生物 专注植提 精于高纯 基于您对天然产物需求持续创新 |