熊果酸对人胃癌细胞株MGC一803的抑制作用及其机制 |
发布时间:2010-09-02 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:3733 |
王琼1,陈建军2,向谨逸3 (1湖北省新华医院,湖北武汉430015;2崇阳县人民医院;3华中科技大学同济医学院) [摘要] 目的观察熊果酸(UA)对胃癌细胞林MGC一803的抑制增殖作用。方法培养胃癌细胞株MGC一803,以MTT比色法及生长曲线测定UA对MGc一803抑制增殖的作用。免疫印记法测定p-ERK.加Cyelin D1、p21训“”1表达。结果MTT实验及生长曲线均显示uA明显抑制MGC一803细胞增殖,免疫印记法显示uA抑制PERK。小Cyel nUI表达,同时上调p21删⋯表达。结论熊果酸可以抑制MGC一803增殖,机制与影响p-ERK。,:及下 游Cyclin D1、p21⋯91表达有关。 [关键词]熊果酸;胃肿瘤;细胞外信号调节激酶;增殖 熊果酸(UA)又名乌索酸、乌苏酸,属于三萜类化台物,广泛存在于熊果、白花蛇舌草、女贞子、乌梅等天然植物和草药中,具有抗炎、护肝、降血脂等多种生物学活性,近年来其抗肿瘤作用日益受到重视。研究发现uA可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡”。J,但作用机制尚不十分清楚。2006年9月一2007年3月,我们使用不同浓度熊果酸作用于胃癌MGC_803细胞株,检测细胞增殖的各项指标,研究P—ERK。、Cyclin D1及p21“J。。“的表达情况,旨在为其用于抗肿瘤治疗方面奠定试验基础。 1材料与方法 I.1材料胃癌细胞株MGC一803由华中科技大学同济医学院实验中心提供。熊果酸购自武汉天源生物技术公司;RPMI 1640培养基、胎牛血清均购自美国Sigma公司;标准蛋白及增强化学发光剂ECL购于New England Biolab公司,小鼠抗大鼠p-ERKI/2、Cyclin DI及p21””1单克隆抗体抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠第二抗体、碱性磷酸酶显色试剂盒 购于北京中山生物公司。 1.2实验方法 1 2.1细胞培养MGC.803细胞在含10%胎牛血清及青、链霉素各l×105 U/L的BPMI 1640培养基中贴壁生长,于37 oC、5%CO2:培养箱中传代培养,取3~6代细胞用于实验。按照培养基中试剂不同,将培养的MGC-803细胞随机分为4组:对照组(培养基);10、20、40 p..mol/L UA组。收集对数生长期的细胞,以5 X105个细胞/ml接种二I_.培养瓶,24 h换液1次。当细胞达到亚融合状态,无血清培养基培养12 h。按分组要求加入不同浓度熊果酸、培养基,使各瓶终体积均为2 m1。12 h后收集细胞,进行F列测定。 1.2.2 M‘rr比色消化处于对数生长期的细胞以5 X t05个细胞/ml接种于96孔板,在37℃、5%CO2,、饱和湿度条件下培养。当细胞达到亚融合状态时,每iL加入200“l无血清培养基,12 h后弃培养基。加入不同量的熊果酸及培养基,各孔终体积均为200山。2 d后弃培养基,每孔加MTF溶液(5 mg/m1)20“l。孵育4 h,每孔加入150“DMSO,振荡10 rain,用酶联免疫检测仪读取每7L OD值(测量波艮620 11111,参考波长490 nRl)。生长抑制率IR(%)=1一B/A X100%(A、B分别为对照组和实验组的光密度值)。 1.2.3生长曲线测定取对数生长期细胞2×104置丁25 m1培养瓶中,培养24 h后,去培养液,加入以上分组的培养液和熊果酸,连续培养6 d,每天取6瓶细胞,以台盼蓝法计算活细胞数,绘制生长曲线。 1.2,4免疫印迹法(Westem blot)检测p-ERK。/2、Cyclin DI、p21““”“蛋白表达取5×105个各组干预后的细胞,加入5倍体积的细胞裂解液孵育20min。取40斗g总蛋白加人卜样缓冲液煮沸变性,经SDS/PAGE凝胶电泳,然后电转移至PVDF膜,封闭后与1:1 000稀释的一抗4℃孵育过夜,再与1:10 000稀释的二抗室温孵育2 h,与增强化学发光试剂温浴5 rain后曝光、显影和定影,对结果进行吸光度扫描分析.并与对照组结果进行对比。 1.3统计学方法所有数据均采用i±s表示,采用SPSS 10.0软件包进行方差分析,以尸≤0.05为有统计学差异。 2结果 2.1 熊果酸对MGC一803细胞增殖的抑制作用MTT比色法检测结果显示,对照组及10、20,40 I.mM/L UA组IR分别为0、12.16%±3.26%、34.36%±6.26%、53.80%±9.22%,后三组均明显高于对照组(P<0.05、<0.01、<0.0l、n=8),且随着浓度升高,IR明显上升。 2.2熊果酸对MGC一803细胞生长曲线的影响见图1。 2.3熊果酸对p-ERKm、Cyclin DI、p21”“叫表达影响见表1。 3讨论 细胞外调节信号激酶(ERK)是MAPK家族的一个亚族,家族中研究最多,也最重要的是ERK。。町被多种生长因子、细胞因子激活,参与调节细胞的增殖与分化。ERK活化后通过转录调节引起多种基因包括细胞周期素Dl(Cyclin D1)等基因的相继激活导致细胞恶性转化,在细胞生长、发育、分裂、死亡及恶性转化等过程中起重要作用.4J。Cyclin D1属细胞周期抑制因子,是G./S期转化的重要蛋白,研究发现其在肿瘤细胞巾表达增高,并与肿瘤细胞异常增殖、侵袭和预后有关。p21””⋯⋯是最早发现和克隆的家族成员之,其羧基端与PCNA结合,使之不能与DNA聚合酶形成复合物,影响DNA复制,阻止细胞周期进程;其氨基端与Cyclin D/E结合,从而使RB蛋白不能磷酸化,使细胞周期停滞于G.期。有研究表明p21““”蛋白与细胞衰老、分化及肿瘤发生、发展有关。 本研究结果显示,熊果酸浓度依赖性抑制MGC一803细胞增殖率。卒文结果亦提示,熊果酸抑制MGC-803细胞生长的作用町能与影响ERK信号通路及其下游信号分子如Cyclin D1、p2i“““有关。但尚不能排除熊果酸对其他促瘸细胞生长的信号通路的干预。 [参考文献] l 1 j HnlInsv F,Ldei M,Csorba G,et d Activation ofcaspase-3 protegeduring the process of ursolic acid aJld its deivatlveinduced apop/osis[J]Anticancer Res.2001,21(5):3485-3491 [2]Baek JH,Lee YS,gang CM,et a1.Intracellular Ca“mIease media-aes u rsolic af id-indu,:ed apoptosis in hu Ellal/leukemic HL—60 cells[J]Int J Cancer,1997,73(5):725-728 [3】Hsu YL,Kuo PL,m CC proliferative inhibltltm,ceHl!yele dys”g—ulation,and induction of apoptosis by ursolic acld in human non-small cell lung eaneer A549 cell [J]. Life Sei, 2004,75(19):2303-2316. [4]褚传莲,李延青,李文捷,等ERKI、ERK2在胃腺癌中的表达及临床意义l J]山东医药,2002,42(22)5-7 产品链接: 杜仲提取物 绿原酸 金银花提取物 苦杏仁苷 枇杷叶提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科罗索酸 上禾生物 专注植提 精于高纯 基于您对天然产物需求持续创新 |