绿原酸(chlorogenic acid)是一种从双子叶植物(如忍冬叶、咖啡豆、向日葵)的叶和果实分离得到的酚类,也是许多中草药(如杜仲、金银花、茵陈等)及中药复方制剂抗菌消炎、清热解毒的主要活性成分,目前已成为中草药制剂质量控制的主要指标之一。中草药是中华民族几千年文明的瑰宝,是我们炎黄子孙的骄傲。千百年来,我们的祖先运用中草药及其复方制剂在防病治病方面取得了异常丰富的临床经验,留下了一大批医药名著。近些年,由于西药的泛滥,病原微生物的变异及抗药性也取得了长足的“进步”,于是,人们重新将目光投向了中草药。特别是在人们日益崇尚天然、无污染食品的“后抗生素”时代,中草药以其独到的优势逐渐受到人们前所未有的青睐,中草药中有效成分的提取工艺、作用机理、应用研究也重新成为医药界追逐的热点,并逐渐成为动物营养界研究的一大方向。
一、 绿原酸的结构和性质 绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。它是一种由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸,quinic acid,即1-羟基六氢没食子酸)缩合而成的缩酚酸,异名咖啡鞣酸,化学名3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquinic acid),分子式为C16H18O9,分子量:345.30,半水合物为针状晶体,110℃时变为无水化合物,易溶于水、乙醇、丙酮,微溶于乙酸乙酯,常温下呈淡黄色固体。
植物中绿原酸的生物合成包括了一系列的酶促反应。在酶的催化下,葡萄糖转化成莽草酸(shikimic acid),后者再转化成苯丙氨酸,最后经合成酶作用得绿原酸。
二 、绿原酸的分布 绿原酸在植物中分布广泛,从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道,但含量较高的植物不多,主要存在于忍冬科忍冬属(Lonicera)、菊科蒿属(Artemisia)植物中,其中包括杜仲、金银花、向日葵、咖啡、可可树。 植物的不同品种、发育阶段、同一植株的不同部位、存放时间、生长环境等均能影响植物中绿原酸的含量。以杜仲为例:叶中绿原酸的含量高于皮中含量数倍之多;用不同干燥方法对绿原酸含量的影响研究中,用阴干、晒干、直接烘干所测绿原酸含量分别是2 .21%、2. 17%和2 .24%;鲜叶绿色含绿原酸3 52%,放置1年后,叶色棕绿,绿原酸含量为2 47%。
三 、绿原酸的提取方法 由于绿原酸是极性较强的有机酸,易溶于醇、水,难溶于氯仿、乙醚,因此绿原酸的提取方法较多,有醇(甲醇、乙醇)溶法、水提醇沉、醇提铅沉、石灰乳沉淀法及聚酰胺柱层析法等。下面介绍几种提取方法。 醇溶法:先用氯仿进行连续提取至流出液呈无色;再改用95%工业乙醇提取,提尽绿原酸;将所得乙醇提取液减压浓缩成浸膏,与干净细沙拌合后,用热水提取数次,使绿原酸转溶于水中,弃去残渣;所得水溶液用乙醚萃取,进一步除去脂溶性杂质;向脱脂后的水溶液中加入饱和无机盐溶液,至沉淀完全,并稍有过量为止。此时,水中的绿原酸与金属离子结合生成不溶性盐;用离心分离法分离出沉淀并除去沉淀中的金属离子后,将所得滤液用有机溶剂萃取数次,回收溶剂,得绿原酸粗品,经分步结晶和重结晶等方法精制,即得绿原酸纯品,得率约为0.5%。 水提醇沉法:采用水为溶剂,加热煮沸提取,但相应地增加其他水溶性成分如蛋白质、多糖、鞣质等杂质,可用传统的醇沉法除去。醇沉过程中伴随吸附和包夹,致使绿原酸有不同程度的损失。提取水提液中绿原酸时,分次醇沉比一次醇沉所得产品纯度高;当乙醇浓度最终为90%时,一次醇沉的损失率比分次醇沉较大。 水提石灰乳沉淀法:在待测物水溶液中,加石灰乳使绿原酸生成钙盐沉淀,用稀酸分解,提取物中绿原酸得率较低,可能因为绿原酸是酯类,被强碱水解所致。 虽然许多研究者对绿原酸含量的测定方法进行了研究或评述,在分析、测定过程中不乏采用层析方法,但各种方法均有其不完善之处,难以分离出全部绿原酸并得到纯品(不包括绿原酸异构体)。
四 、绿原酸的测定方法 同样,绿原酸的含量测定方法有许多种。由于许多物质同绿原酸分子结构相似,同存于一种药材或制剂中。因此在进行含量测定时常难以分离。常用分析方法有紫外分光光度法(UV)、高效液相色谱(HPLC)法等。这些方法要么难以完全分离待测物质,要么易受干扰,或者分析时间长、效率低。现在在中药成分分析中开始采用一种新技术即高效毛细管电泳(HPCE) 技术。它具有高分离效率、分析时间短、进样量少、低检测限和重现性好等特点。但由于在中药材的成分分析中才刚应用,效果如何还有待评价。下面介绍一种检测方法。 1. 标准曲线的绘制 精密称取绿原酸标准品80mg,用95%乙醇溶解,转移到250ml容量瓶中,加95%乙醇到刻度,混匀。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml到250ml容量瓶中,加95%乙醇到刻度,混匀,此为标准系列溶液。在330nm处测定吸光度,以绿原酸标准品的浓度为横坐标,以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线,并求出相应的回归方程。 2. 样品中绿原酸含量的测定 (1)提取液的制备 准确称取中草药提取物样品各1.0835g,置于250ml锥形瓶中,量取约50ml95%的乙醇溶解样品,并置于85℃的恒温水浴箱中,回流4h。放置、冷却至室温,过滤,然后加95%的乙醇将提取液定容于250ml容量瓶,待用。 (2)含量测定 准确吸取样品提取液5ml于25ml容量瓶中,加95%的乙醇稀释到刻度,得到待测样品液。以95%的乙醇作空白,在330nm处测定吸光度,由标准曲线计算出待测样品液浓度。 3. 回收率的测定 准确称取中草药提取物样品0.20g,分别加入一定量的绿原酸标准品,按上述操作方法进行,用紫外分光光度法测定吸光度,得出绿原酸含量,根据回收率公式计算出回收率,重复6次。 用紫外分光光度法测定绿原酸含量,相对标准偏差较小,结果重现性好,精密度高。
五 、绿原酸的作用机理 1.对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用 透明质酸梅(HAase)是裂解粘多糖的酶之一,可催化透明质酸(HA)的分解,关系到血管系统的通透性和炎症反应。HA是由糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖组成的一种粘多糖,具有多种功能,如治愈创伤,使皮肤润湿健康,润滑关节和防止炎症等。从狭叶紫锥花(Echinacea amgustifolia DC)根的乙酸乙酯提取物中发现3,5-二咖啡酰奎尼酸(朝鲜蓟酸)和绿原酸有较强的抑制HAase激活的作用。 动物体外的研究证明,绿原酸能不可逆地抑制葡萄糖-6-磷酸酶的水解作用,降低肝糖原的分解并减少外源葡萄糖的吸收。动物体内的研究证明,使用绿原酸可以降低由使用胰高血糖素引起的(肝糖分解造成的)高血糖峰值。因此,绿原酸可以降低血糖水平,提高肝脏葡萄糖-6-磷酸和肝糖原的浓度。 2.自由基的清除及抗脂质过氧化作用 绿原酸抑制前列腺素代谢中脂氧化酶活性,抑制维生素A的氧化,保护肾上腺素免受氧化,抗维生素A酸(retinoic acid)5,6-环氧化的生物活性,绿原酸甲酯和二咖啡酰奎尼酸可抑制线粒体和微粒体脂质过氧化。 绿原酸和3,5-二咖啡酰奎尼酸属于小分子化合物,能与过氧自由基快速反应,因此它们是潜在重要的生物抗氧化剂。其可能的抗氧化机制为:儿茶酚类(catechols)部分作为过氧自由基接受氢原子供体,继而转化成低活性产物。因此,它们可终止链自由基反应。 3.抗癌变作用 绿原酸是植物代谢中的一种重要物质,也是促佛波醇酯活性肿瘤的抑制剂。近来,日本学者研究了杜仲茶的变异原性抑制作用(Antimutagenicity)与杜仲叶所含的绿原酸、京尼平甙、京尼平甙酸等抗变异原性成分有关,揭示了杜仲茶对肿瘤的预防具有重要意义。 4.预防心血管疾病 绿原酸是咖啡中一种主要的酚类化合物。日常引用咖啡的人每日摄取量为0.5—1g。绿原酸和咖啡酸在体外是抗氧化剂,因此可能对预防心血管疾病有作用。 5.抗菌、抗病毒作用 绿原酸和异绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用。绿原酸有利胆、降压、抗菌、消炎及升高白细胞、显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等药理作用。
六 、 绿原酸及中草药制剂在动物饲料中的作用 到目前为止,尚没有单一绿原酸添加剂用于动物饲料的研究报道。大部分报道集中于中草药及其提取物(含多种成分)对动物生产性能的影响,且主要是杜仲(叶)。 日本高桥试验证实,杜仲饲料添加剂有良好的饲养效果。他们在人工养殖的蟮鱼饵料中添加2.5%的中国产杜仲粉。试验结果表明,杜仲饲料添加剂能提高蟮鱼肌肉强度, 降低肌纤维粗度,提高肌胶原蛋白含量,降低体脂肪含量,从而改善蟮鱼肉的烹调风味。罗庆华(2002)将杜仲叶粉添加于鲤鱼饲料中投喂鲤鱼30天,其血清抗体效价、白细胞的吞噬活性均显著提高。活菌攻毒后存活率也明显提高,且试验组鲤鱼食欲要好于对照组,其生长速度快于对照组,说明杜仲叶粉既可提高鲤鱼的营养价值,又可使肌肉更鲜嫩并可加快鲤鱼的生长速度。 王介庆(1988)在AA蛋鸡和本地蛋鸭的饲料中添加0.5%杜仲饲料添加剂,试验结果显示,试验组比对照组蛋鸡开产期提前10d,产蛋率提高6%,试验组比对照组蛋鸭开产期提前8d,产蛋率提高8%。 王于东(1997)用杜仲叶喂牛,日增重提高6.3%,饲料利用率提高10.2%,经济效益提高12.8%。王介庆(2001)以杜仲提取液饲喂断奶仔猪和獭兔,使仔猪增重率提高28.6%,料耗降低17.3%,獭兔提高日增45.9%并提高了毛皮的质量。 总之,绿原酸具有广泛的抗病毒、抗菌功能,且毒性和副作用较小,不容易引起病原微生物的耐药性,因此可被广泛用作食品、化妆品和饲料的抗病原添加剂。大量实践充分证明,中草药饲料添加剂代替抗生素作动物抑菌促生长剂是完全可行的,不但可以获得良好的防病、抗病和促生长效果,而且还解决了抗药性和药残问题。发展天然中草药饲料添加剂替代抗生素类饲料添加剂,生产天然、安全、健康的动物性食品对于我国饲料工业和畜牧业以及人类健康都具有重大意义。 |