二氢杨梅素的分离研究进展 |
发布时间:2010-08-21 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2668 |
严赞开( 韩山师范学院化学系, 广东潮州521041)
摘要综述了二氢杨梅素的分离研究进展, 为深入研究二氢杨梅素的提取及纯化工作提供参考。 关键词二氢杨梅素; 提取; 纯化
Research Progress onthe Methods of Isolation of Dihydromyricetin YAN Zan-kai ( Department of Chemistry ,Hanshan Normal College ,Chaozhou,Guangdong 521041) Abstract Research progress onthe method of isolationof dihydromyricetin was summarized , which will provide references for further study of extraction and purification of dihydromyricetin. Key words Eihydromyricetin ; Extraction; Purification
二氢杨梅素( 3 ,5 ,7 ,3’,4’,5’- 六羟基-2 ,3- 双氢黄酮醇,Dihydromyricetin,DMY) 是一种多羟基双氢黄酮醇, 又称蛇葡萄素。该化合物除具有黄酮类化合物的普通特性之外, 在解除醇中毒、抗高血压、抑制体外血小板聚集和体内血栓的形成、降低血脂和血糖水平、提高SOD 活性以及保肝护肝等方面具有特殊功效[ 1 - 2] 。据《植物药有效成分手册》记载, 该化合物存在于杨梅科、杜娟科、藤黄科和大戟科等植物中[ 3] , 但由于在以上植物中含量较低, 一直无法进行大规模的应用和实验。周天达等从显齿蛇葡萄的幼嫩茎叶中首次分离得到二氢杨梅素, 并测定出蛇葡萄幼叶中二氢杨梅素的含量高达30 %以上, 二氢杨梅素的研究才引起人们极大的关注和重视[ 4 - 9] 。随着二氢杨梅素研究工作的不断深入, 其显著的药理活性及抗氧化活性已成为黄酮类化合物的研究热点之一。 目前, 在我国的江西、湖南、湖北及四川等省均已建立了万亩以上规模的蛇葡萄( 俗名藤茶) 种植基地, 为开发和利用好这一宝贵资源, 笔者将近年来国内外二氢杨梅素的提取及纯化方法作简要概述。 1 提取方法 黄酮类化合物的提取工艺, 主要包括有机溶剂提取、热水提取、碱液提取、超滤法提取、超声技术提取、微波技术提取和超临界流体萃取法提取等[ 10] 。二氢杨梅素属多羟基黄酮类化合物, 具有很强的极性, 易溶于水、乙醇中, 运用水和乙醇来提取二氢杨梅素最为广泛。从蛇葡萄中提取二氢杨梅素主要有采用热水、乙醇萃取及微波辅助萃取等方法[ 11] 。 1 .1 溶剂萃取 1 .1.1 热 水萃取。张友胜等运用重量法测定了二氢杨梅素在不同温度下在水中的溶解度, 结果表明, 随着水温的上升,二氢杨梅素在水中的溶解度逐渐增大, 其中在室温( 23 ℃) 和沸水( 100 ℃) 下二氢杨梅素的溶解度分别为0 .187 6 和1 .505 0 g/ 100 ml , 运用沸水提取二氢杨梅素效率较高[ 11] 。李卫等以水为溶剂, 运用逆流法提取二氢杨梅素, 提取效率随温度升高而增加, 随pH 值的增大略有增加, 但碱性太强易导致二氢杨梅素开环, 在pH 值为8 ~9 的沸水中提取较为适宜; 当固液量比为1∶10 , 沸水提取60 min, 冷却后结晶, 提取效率为11 .00%[ 12] 。覃洁萍等用沸水回流提取, 浓缩后析出黄色结晶, 用丙酮重结晶, 得白色结晶, 提取效率为19 .60 %[ 13 - 14] 。 1 .1 .2 乙醇萃取。有机溶剂提取黄酮类化合物, 常用的溶剂有甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液和乙酸乙酯等, 考虑到食用及药用的安全性, 乙醇水溶液作为提取剂较为普遍。王岩等以乙醇为溶剂, 对乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数4 个因素, 采用L9( 34) 正交试验设计, 得到最佳提取工艺为:80 % 乙醇为溶剂, 乙醇用量为药材量的10 倍, 加热回流2 次, 每次60 min, 提取效率为8 .98 %[ 15] 。笔者等比较了水、不同浓度乙醇、氢氧化钙饱和溶液等浸提剂的提取效率, 筛选出50% 乙醇为最佳提取剂; 并选取乙醇的浓度、提取时间、料液比3 因素3 水平进行正交试验, 得到最佳的提取工艺条件为: 以50% 乙醇为提取剂, 按45 倍蛇葡萄干叶的量加入50% 乙醇, 保温回流2 h, 提取平均效率为17 .80%[ 16] 。郑成等采用乙醇浸泡进行预处理, 以水为溶剂提取二氢杨梅素, 通过先单因素分析, 后正交设计试验, 确定了最佳提取工艺条件为: 按蛇葡萄干叶8 倍的量加入95 % 乙醇, 冷浸15 h 后, 再加入固样量20 倍的沸水, 保温回流30 min, 二氢杨梅素的提取率为34 .23%[ 17] 。 1 .2 微波辅助萃取微波萃取法是利用在微波场中, 吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热, 从而使得被萃取物质从基体或体系中分离, 进入到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中。利用微波辅助浸提, 一般1 次只要数分钟的时间即可达到传统浸提数小时的效果, 可以避免长时间高温引起物质的分解, 特别适合于处理热敏性组分或从天然物质中提取有效成分, 是一种具有良好发展前景的萃取分离方法。杨铃等采用微波辐射萃取, 选定浸提的固液比、微波萃取温度和微波辐射时间等为主要影响因素, 每种因素选择3个水平, 采用L9( 33) 正交试验设计, 结果表明, 以水为提取剂, 在95 ℃下、微波辐射15 min、料液比为1∶20 时, 二氢杨梅素的提取率为26 .70 %[ 18 - 19] 。郑成等系统地研究了二氢杨梅素的微波辅助提取方法, 所得的最佳提取工艺条件为: 以水为提取剂, 微波照射时间为20 min, 加热时间50 min, 料液比为1∶10 时, 二氢杨梅素的提取率为25 .11%[ 20 - 22] 。 1 .3 超声波辅助萃取超声波提取技术是以超声波辐射压强产生的骚动效应、空化效应和热效应, 引起机械搅拌、加速扩散溶解的一种新型提取方法。该方法能够更有效地提高有效部位提取率, 瞬间稳定升高温度对热不稳定成分影响较小。姚茂君等对显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的超声辅助提取工艺进行了研究, 在单因素试验和正交试验的基础上, 得出超声波法辅助溶剂提取显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的最佳工艺条件为: 以65 % 乙醇溶液为提取剂, 在40 ℃ 下、料液比1∶15 、超声波辅助提取40 min 时, 二氢杨梅素的提取率达19 .30 %[ 23] 。 1 .4 超临界萃取超临界流体萃取是控制超临界流体在高于临界温度和临界压力的条件下, 从目标物中萃取成分, 当恢复到常压和常温时, 溶解在超临界流体中的成分立即与气态的超临界流体分开。由于其介质通常为无毒的CO2 , 对产品没有毒, 特别适合于医药、食品添加剂等产品的提取。沈露等采用CO2 超临界流体萃取技术, 对显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的提取进行了研究, 通过正交试验确定二氢杨梅素的最佳提取条件为: 萃取压力25 MPa 、萃取温度50 ℃、萃取时间1 .5 h、CO2 流量为20 L/ h 时, 萃取得率为15 .40 % , 纯度85 .5 %[ 24] 。 2 纯化方法 2 .1 重结晶法重结晶是利用固体混合物中目标组分在某种溶剂中溶解度随温度变化的明显差异, 在较高温度下溶解度大, 降低温度时溶解度小, 从而实现分离提纯。二氢杨梅素是极性化合物, 在其水提物中, 不可避免地含有单宁质、蛋白质、糖类、盐类以及色素等杂质, 这些杂质以结合态或游离态形式与二氢杨梅素共存, 需经过多次重结晶除去杂质。二氢杨梅素在热水中的溶解量约为在冷水中的30 倍, 而且采用水加热重结晶提纯法具有操作简便、安全、廉价的特点。高建华等经反复5 次热溶重结晶, 粗提取物单宁质由原来的1 .60% 减少到0 .26 % , 二氢杨梅素的含量从51 .00% ~86 .00 % 增加到96 .50% 以上, 结晶体呈淡黄色, 无苦涩味, 微甘, 重结晶得率为42 .30 %。笔者等采用双溶剂法重结晶, 用38 倍的无水乙醇溶解粗提物, 用少量活性炭脱色, 趁热过滤后蒸出大部分乙醇, 将残留液倒入4 倍的水中, 陈化结晶, 经2 次重结晶, 二氢杨梅素的含量从50 .00% 提升到90 .00 % 以上 。 2 .2 层析分离法层析分离法是基于样品组分在互不相溶的“两相”溶剂之间的分配系数不同而分离, 因而层析技术又分为凝胶色谱、吸附树脂和离子交换树脂技术、高效液相色谱制备技术以及逆流色谱制备技术等。 2 .2.1 吸 附树脂法。大孔树脂吸附分离技术是利用一类有机高聚物吸附剂, 有选择地吸附有效成分, 再经洗脱回收, 除掉杂质的一种纯化精制的方法。张友胜等采用大孔吸附树脂D- 16 ( 非极性, 粒径范围为0 .30 ~1 .25 mm) , 运用“增温溶解保温过柱, 温水解吸”的方法纯化二氢杨梅素, 可将80 .00 %二氢杨梅素纯化达到90 .00% , 进一步利用重结晶可以制备纯度达95 .00% 以上的二氢杨梅素 。甘春丽等用乙醇∶乙醚( 1∶2) 混合溶液溶解粗提物, 与聚酰胺拌样, 待溶剂完全挥干后, 加到预处理过的聚酰胺柱, 依次用水,20 % 、30% 、40 % 、50 % 、70% 和95 % 乙醇梯度洗脱得二氢杨梅素纯品[ 29] 。 2 .2.2 硅 胶色谱法。普通柱层析是利用硅胶或氧化铝等常用的吸附材料作为固定相, 以单组分或多组分有机溶剂作为流动相对样品进行洗脱, 最终达到成分分离的效果。这种方法操作简单, 但对于成分比较复杂或结构相近的成分来说,常常得不到理想的分离效果。何桂霞等用硅胶G-CMC-Na 为固定相( 105 ℃活化0 .5 h) , 以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸( 10∶8∶5)为展开剂, 用3% FeCl 3 乙醇溶液喷雾显色, 分离出二氢杨梅素纯品[ 30] 。 2 .2.3 高 效液相色谱法。高效液相色谱分离技术是将流动相由高压泵打入系统, 样品溶液经进样器进入流动相, 被流动相载入色谱柱( 固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次吸附一解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 达到组分分离的目的。高效液相色谱分离技术具有分离速度快、效率高的优点。何桂霞等用Novapak C18 色谱柱( 150 .0 mm×4 .6 mm,5 μm) , 甲醇∶水∶磷酸( 27 .0∶73 .0∶0 .1) 为流动相, 流速为1 .0ml / min; 进样量20 μl , 柱温25 ℃, 保留时间为9 .56 min , 分离得到二氢杨梅素纯品[ 31] 。 2 .2.4 高 效逆流色谱法。高效逆流色谱分离技术是运用动态液一液分配原理, 利用螺旋管的方向性与高速行星式运动相结合, 使两相互不混溶的溶剂在螺旋管中实现高效接触、混合、分配和传递, 从而将具有不同分配比的样品组分分离出来。与其他液相色谱分离技术相比, 该技术不使用固相载体作为固定相, 样品在互不相溶的两相中分配, 克服了固相载体带来的样品吸附、损失和污染等缺点, 并能重复进样, 应用价值较高。张友胜等用Hyper ODS2 C18 高效液相色谱柱( 250 .0 mm×4 .6 mm,5 μm) , 乙腈∶水∶醋酸( 10 .0∶90 .0∶0 .1) 为流动相, 流速为1 .0 ml / min ; 进样量20 μl , 柱温35 ℃, 能有效地将80 .00% 粗产品纯化至90 .00 % 以上。 3 小结 ( 1) 提取方法。二氢杨梅素分子具有很强的极性, 采用水、乙醇均有良好的萃取作用, 无极性的CO2 超临界萃取则效率不高, 因此可选用水、乙醇水溶液作萃取剂。乙醇溶剂法萃取, 虽然效率会略比水高, 但需要回收溶剂, 增加生产成本, 工业生产用水作萃取剂较好; 用水作萃取剂, 用辅助微波装置, 可获得很高的萃取效率, 是工业生产的发展方向。郑成等以干藤茶叶为原料, 研究了二氢杨梅素规模微波提取的工艺, 通过正交试验确定最佳的提取工艺条件, 提取率高达28 .78 %[ 33] 。 ( 2) 纯化方法。以二氢杨梅素粗提物为原料, 纯化二氢杨梅素可根据纯度要求选择纯化方法。重结晶法和吸附树脂法的特点是单次处理的样品量较大, 所得二氢杨梅素的含量一般可达90 .00 % 以上; 与吸附树脂法相比, 重结晶法操作简便、成本低, 工业化生产优势明显。高效液相色谱及高效逆流色谱分离的特点是速度快、产品的纯度高, 但单次分离的样品量少, 可用于科学研究小量高纯样品的制备。近期张友胜等采用GS10A 型逆流色谱仪和AKTAprime plus 层析系统共同组成的高速逆流色谱联用系统, 对藤茶提取物中的二氢杨梅素进行纯化, 选用溶剂系统为石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶三氯乙酸( 体积比1 .00∶3 .00∶2 .00∶2 .00∶0 .05) , 可将粗提物中的二氢杨梅素提纯到99 .00 % 以上,5 h 内可纯化50 g粗样品, 分离得率为85 .50%[ 34] 。 参考文献 [1] 张友胜, 宁正祥, 胡闫勇. 黄酮类化合物二氢杨梅素的研究利用现状[J] . 中成药,2002,24(12) :970 - 972 . 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