熊果酸体内抗肺癌作用机制探讨 |
发布时间:2010-08-16 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2229 |
【摘要】 探讨熊果酸对人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制。方法:采用人肺腺癌A549细胞株进行裸鼠移植瘤实验。通过移植瘤生长曲线、终末瘤重计算抑制率观察熊果酸对人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用,采用免疫组化法检测VEGF蛋白表达、微血管密度,TUNEL检测凋亡指数,探讨其作用机制。结果:实验组用药后移植瘤生长缓慢,实验结束时,实验组瘤重及瘤体积明显低于对照组(P<0.05),抑瘤率为51.35%。实验组移植瘤组织微血管密度及VEGF蛋白表达明显低于对照组(P均<0.01),实验组癌细胞凋亡指数高于对照组(P<0.01)。结论:熊果酸对裸鼠肺腺癌移植瘤生长有抑制作用,其机制可能与降低移植瘤促血管生成因子VEGF的表达、抑制新生血管的形成和促进肿瘤细胞凋亡有关。 【关键词】 肺肿瘤 细胞凋亡 血管生成 熊果酸 [ABSTRACT] Objective: To study the inhibitory effect of ursolic acid on the transplanted human lung adenocarcinoma cell line A549 in nude mice and explore its mechanism. Methods: The nude mice bearing A549 cancer cells were established in vivo. The transplanted tumor growth curve was drawn, and the inhibitive ratio was calculated according to tumor weight. Immunohistochemistry (SP)was used to examine the expression of VEGF and MVD of the transplanted tumor, and TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated UTP nick end labeling) was used to examine the apoptosis index of the transplanted tumor. Results: The transplanted tumor of the treated group grew slowly. The volume and the weight of tumors in the treated group were smaller than those in the control group. The tumor inhibitive rate was 51.35%. The expressions of VEGF and MVD in the treated group were lower than those of the control group, and the apoptosis index of the transplanted tumor in the treated group was higher than that in the control group(P<0.01). Conclusion: Ursolic acid has an antiangiogenesis activity on the human lung adenocarcinoma cell line A549 in vivo by inducing the apoptosis of the cancer cells, deceasing the VEGF expression and inhibiting the vasoformation of the transplanted tumor. [KEY WORDS] Lung cancer; Apoptosis; Angiogenesis; Ursolic acid 熊果酸(ursolic acid),又名乌索酸,属于α香树脂醇型五环三萜类化合物,有广泛的生物学效应和药理活性。近年研究表明,熊果酸不仅对多种致癌、促癌物质有抵抗作用,而且在体外能抑制多种肿瘤细胞的生长[1],并可抑制血管内皮细胞(VEC)的活化、增殖、迁移,具有抑制血管形成的作用[2]。本研 究探讨熊果酸体内对人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用,通过检测移植瘤细胞的凋亡、组织中微血管密度及VEGF蛋白表达,观察其对瘤组织血管形成和细胞凋亡的影响,对其作用机制进行初步探讨。 1 材料与方法 1.1 细胞株与细胞培养 人肺腺癌A549细胞株由山东省医学科学院基础所惠赠,培养在含10%小牛血清、青霉素及链霉素各100?U/ml的RPMI1640培养液中,37?℃、5%CO2饱和湿度条件下培养,0.25%胰蛋白酶消化传代。 1.2 实验动物与试剂 BALB/C(nu/nu)裸小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司,12只,SPF级,鼠龄3 4周,体重17 20?g,雄性,饲养于超净生物层流架内,环境定期紫外线消毒,保持恒温(25±2)℃、恒湿(45% 50%),笼具、饮水均经高压蒸汽灭菌,实验操作均在无菌罩内进行。熊果酸纯品购自Sigma公司;血管内皮生长因子(VEGF)鼠单克隆抗体、CD34鼠单克隆抗体、羊抗鼠、羊抗兔IgGHRP、SP试剂盒、TUNEL 试剂盒、DAB均购自北京中山生物技术有限公司。 1.3 方法 1.3.1 熊果酸对裸鼠肺癌移植瘤的抑制作用 将A549细胞按常规方法复苏扩增,消化后无血清培养液离心洗涤2次,计数并调整细胞浓度为5×106个/ml,台盼蓝染色活细胞计数>99%。用带6号针头注射器抽取癌细胞悬液接种于裸鼠右前腋部皮下,每个部位接种0.2?ml,成瘤后随机分为实验组和对照组,每组6只。实验组给予熊果酸50?mg/(kg·d)溶于0.2?ml生理盐水,对照组给生理盐水0.2?ml/d,均行腹腔注射,1次/d,连续治疗20?d。实验中注意观察裸鼠精神、进食、排便及体重情况。隔天用游标卡尺测量肿瘤长径a和短径b,按公式V=0.5×a×b2计算移植瘤体积,绘制生长抑制曲线。最后1次用药24?h后以脱颈方式处死裸鼠,剥出肿瘤,计算各组平均瘤重及抑瘤率(Inhibit Rate,IR)。 IR=〔(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重〕×100%。 1.3.2 病理学检查 对裸鼠进行解剖,肉眼观察重要脏器及淋巴结情况,取肿瘤及重要器官组织以10%福尔马林固定、石蜡包埋切片, HE染色,光镜下观察组织结构变化。 1.3.3 免疫组化法检测移植瘤VEGF蛋白表达和微血管密度计数 免疫组化染色采用链霉菌素-生物素(SP)免疫组化技术, 移植瘤石腊标本4?μm切片2张,常规脱腊,组织抗原修复采用微波抗原修复法,VEGF和CD34一抗工作浓度均为1∶50,具体染色步骤按照试剂盒说明书操作,将已知的乳腺癌阳性切片作阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照。 VEGF蛋白的阳性表达为癌细胞质或细胞膜内出现棕黄色颗粒。按照Breasalier[3]的方法判断染色结果,根据细胞染色强度分为4级,并分别记分:细胞无着色为阴性(0分);着浅黄色为弱阳性(1分);着棕黄色为中度阳性(2分);着棕褐色为强阳性(3分)。在每张切片上随机选取10个视野(10×10),计数每一强度视野数所占的比率(F),根据下列公式计算每张切片的平均染色强度(intensity score,IS)。IS=Σ[(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)],F=10×视野%。 微血管密度(MVD)的判断以CD34标记微血管,计算瘤内着色的毛细血管和微小血管。按照Weidner[4]的评判标准,凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个血管计。低倍镜下选择微血管最密集的3个视野,在高倍镜视野范围内,计数所有的染色微血管数,取3个视野计数结果的均数为该切片的微血管数。 1.3.4 原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)法检测移植瘤的细胞凋亡 移植瘤石蜡切片常规脱蜡,操作步骤按照试剂盒说明书进行,苏木素复染细胞核。将已知的阳性切片作阳性对照,以不含末端脱氧核糖核酸转移酶的标记液处理的切片作阴性对照。细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞,随机选10个视野,每个视野观察100个细胞,计数阳性细胞数,计算凋亡指数(apoptotic Index, AI)。AI(%)=阳性细胞计数/观察细胞总数×100%。 1.4 统计学处理 数据处理采用SPSS10.0 for windows软件包,组间差异选用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 熊果酸抑制裸鼠移植瘤的生长及抑瘤率 两组裸鼠移植瘤的生长曲线见图1。实验组在用药6?d后出现生长抑制,移植瘤体积增长缓慢。实验结束时,两组裸鼠的鼠重、瘤重、瘤体积见表1。由表1可见,两组裸鼠的体重无明显差别,与实验前比较有增长但改变不明显,治疗结束时治疗组移植瘤的瘤重及体积明显低于对照组(P<0.05),抑瘤率为51.35%。肉眼观察各组裸鼠重要脏器及淋巴结未见明显的转移病灶,但对照组移植瘤均不同程度的侵犯右前肢肌肉组织,且瘤体表面微血管丰富。而实验组均无上述表现。实验组裸鼠心、肝、肾、肺、脑等组织切片HE染色均未见病理性改变。实验组裸鼠一般情况均无明显变化,未观察到药物相关性副作用,如活动迟缓、腹泻、厌食、精神萎靡等症状。对照组移植瘤HE染色切片显示癌细胞密集,呈团块状分布,有明显的异质性,核大深染,核仁明显,胞浆丰富,可见较多核分裂像与微血管形成,间质极少。而实验组癌细胞排列较稀疏,呈不同程度的退行性变,核深染固缩,核浆比例减少,可见大片无结构的坏死区,核分裂像与微血管形成较少。图1 两组裸鼠移植瘤的生长曲线 2.2 移植瘤组织内的VEGF蛋白表达和微血管密度计数 VEGF阳性表达位于癌细胞的细胞质内,呈棕黄色颗粒,细胞膜也可见弱表达,CD34标记血管内皮细胞,内皮细胞被染成棕黄色,两组移植瘤组织均有阳性表达,有的形成管腔,有的为单个内皮细胞或内皮细胞簇。肿瘤边缘组织的MVD高于瘤中央。实验组VEGF表达和MVD均明显低于对照组(P均<0.01),见表2。nVEGFMVD计数对照组62.6±0.3242.1±3.9实验组617.1±2.2* 3 讨 论 据不完全统计,熊果酸以游离形式或与糖结合形式分布于大约34个科46个属的108种植物中。熊果酸具有广泛的生物效应,体外实验表明,熊果酸具有多种抗肿瘤活性[5]。本实验通过人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤,观察熊果酸的体内抗肺癌作用,结果显示,用药后实验组移植瘤生长速度明显低于对照组,治疗结束时实验组瘤重及瘤体积明显低于对照组(P<0.05),抑瘤率为51.35%。表明熊果酸可以抑制肺癌移植瘤的生长。实验结束时,实验组裸鼠心、肝、肾、肺、脑组织HE染色切片显示组织结构正常,未见异常病灶,而实验组裸鼠也未发现其它药物相关不良反应,表明其抗肺癌作用时对机体无明显的毒副作用。 为进一步探讨熊果酸抗肺癌机制,我们检测了两组移植瘤组织内的VEGF蛋白表达和微血管密度计数以及癌细胞的凋亡指数。结果显示,实验组VEGF表达和MVD均明显低于对照组(P <0.01)。实验组移植瘤组织AI为12.3±1.2,对照组AI仅为2.3±2.1,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01)。表明熊果酸可以抑制移植瘤组织的血管形成,诱导肿瘤细胞凋亡。 肿瘤组织的新生血管形成在肿瘤的生长、浸润和转移中起着重要作用。在肿瘤细胞恶性转化过程中,因微环境改变(缺氧、pH值下降、NO升高)、突变型p53、ras等基因上调VEGF等血管生成因子以及肿瘤细胞与内皮细胞双向旁分泌作用(相互释放促生长因子),则启动肿瘤细胞的血管生成开关,激活血管生成因子,促进内皮细胞增殖、迁移,形成血管芽及微血管,同时也激活基质金属蛋白酶活性,使细胞外基质降解,利于血管形成、延伸及肿瘤生长、浸润和转移。而VEGF是目前所知最强的、直接作用于血管内皮细胞的血管生成促进因子。Sohn等[6]以鸡胚胎绒毛膜实验模型进行研究,结果显示,熊果酸具有较强的血管生成抑制作用,并有剂量依赖性。本研究结果显示,熊果酸明显降低移植瘤的VEGF表达和微血管密度,表明它可以在体内抑制肺癌血管生成,从而抑制肺癌增殖,证明熊果酸是有效的肺癌血管抑制剂,而其抑制血管生成的机制与下调移植瘤VEGF表达有关。抗血管生成可能是熊果酸抗肺癌的机制之一。 细胞凋亡是受基因调控的一种主动性细胞自杀过程,具有独特的生化和形态特征。对肿瘤生长起着负调控作用,是抗肿瘤的重要途径。Kim等[7]的研究显示,熊果酸使p21WAFI表达增加,导致细胞色素C释放和caspase3激活,抑制DNA复制,从而导致肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期终止。Harmand等[8]在对HaCat细胞的研究中也得到同样的结论,推测熊果酸诱导的细胞周期停滞可能是由p21WAFI起作用,同时使392位的丝氨酸磷酸化易位到核内,使p53获得抗肿瘤活性。我们运用TUNEL法检测移植瘤组织的凋亡指数,结果表明,实验组移植瘤组织中癌细胞凋亡率显著增加,提示熊果酸在体内具有诱导肺癌细胞凋亡的作用。以此我们可以认为,诱导细胞凋亡也是熊果酸体内抑制肺癌生长的机制之一。 【参考文献】 相关产品链接: |