熊果酸对前列腺癌细胞作用的实验研究 |
发布时间:2010-08-06 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:2716 |
雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)的发生是前列腺癌 (PCa)内分泌治疗的主要障碍。维持或恢复PCa细胞对雄激 素的反应性,延缓甚至阻止雄激素非依赖表型的出现,是目前探索和研究的方向。本实验选用中药有效成分熊果酸体外作用于PCa细胞,以探讨AIPC的治疗途径及药物。 1 材料与方法 1.1 细胞系:人雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)细胞株LNCaP 和人AIPC细胞株DU145由本实验室保存,培养基为RPMI一 1640。 1.2 药物及试剂:熊果酸纯品,DMSO 助溶。MTI"、人工合成雄激素R1881和雄激素阻断剂氟他胺均 为Sigma公司产品。RPMI1640培养基(含和不含酚红)及活性 炭/葡聚糖处理的胎牛血清为Hyclone公司产品。 1.3 细胞生长分析:取对数生长期的LNCaP及DU145细胞,接种96孔培养板(LNCaP:6 x 10 个细胞/孔,DU145:4×10 个 细胞/孔)。每组设三个复孔,每孑L终量200 l,均含相同浓度 的乙醇(0.叭%)或DMSO(0.1%)。① 不同浓度熊果酸对LN— CaP、DU145细胞生长变化的影响:熊果酸按浓度倍比稀释法设 8个浓度(0、2.5、5.0、10、20、40、80、160 g/m1)。实验分为三 组:LNCaPR组:正常雄激素培养(不含酚红的RPMI1640—10% 无激素FBS+0.1 nmmolfL的R1881);DU145 R组:正常雄激素 培养(0.1 nmmoL/L的R1881);DU145 F组:雄激素阻断培养(培 养基中不含雄激素且加入1 000 nmmolfL氟他胺),每组均加入 不同终浓度的熊果酸。②熊果酸对不同浓度雄激素时LNCaP 细胞生长的影响:根据浓度抑制曲线,以20斗g/ml作为熊果酸 的实验浓度。实验分两组,R组:不同浓度R1881培养组(0、 0.01、0.1、1、10 nmmol/L);R+U组:不同浓度R1881+熊果酸。③MTr法检测:细胞培养24、48、72、96、120 h,于每孔内加 MTT液(5 mg/m1)20 1,继续培养4 h终止。吸弃培养上清,于 每孑L内加入150 l DMSO,振荡,使MTT结晶充分溶解。选择 575 nm波长,于酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收度(OD 值)。 1.4 数据分析及统计学处理:以MTT测定结果计算每孔的平均光吸收度及细胞生长抑制率,分别作出浓度一生长曲线和时 间一生长曲线,根据数据及曲线分析结果。 2 结果 2.1 不同浓度熊果酸对LNCaP及DU145细胞生长的影响:熊果酸对两种前列腺癌细胞的生长均呈浓度及时间依赖性抑制。 20 ml浓度的熊果酸对LNCaP和DU145细胞为有效抑制浓 度,此浓度下96 h时抑制率近50% (LNCaP)或大于50%(DU145)(图1)。雄激素阻断剂氟他胺对DU145细胞的生长 无明显影响。熊果酸对DU145细胞具有浓度和时间依赖性抑制效应,熊果酸的作用后再应用氟他胺比单纯熊果酸的作用要明显,对细胞抑制率明显上升(作用96 h后抑制率升高10%) (图2) 2.2 熊果酸对不同浓度R1881环境下LNCaP生长的影响: LNCaP细胞的生长依赖雄激素的存在,在不同浓度的R1881环 境中LNCaP细胞的浓度生长曲线呈钟型,0.1 nM浓度为最适 R1881生长浓度(图3)。熊果酸(20 m1)对不同浓度R1881 环境下的LNCaP细胞均呈剂量和时间依赖性抑制,熊果酸作用后,LNCaP细胞生长曲线仍呈钟型,但曲线顶点右移至1.0 nM 附近,最适R1881浓度上升了l0倍以上(图4),即雄激素激发 LNCaP细胞生长的阈值明显提高。 3 讨论 熊果酸(ursolic acid)是存在于天然植物中的一种三萜类化 合物,具有调节激素平衡和脂质代谢 J,减少炎症因子分泌的 功能 。,体内外能抑制多种肿瘤细胞的生长,有明显细胞毒作用和诱导分化作用 J,对一些临床具有内分泌性质的肿瘤如小 细胞肺癌、甲状腺癌等有明显的抑制作用[4i。PCa的形成是多 素、多基因突变的过程,内分泌一代谢系统紊乱是其发病的基础 ,去雄激素治疗加重了这种紊乱是促进雄激素非依赖进 展的重要原因。熊果酸的这些生物学作用,使其对激素调节性肿瘤尤其是PCa可能会有较好的治疗作用,有望通过调节甾体 激素及炎症因子的分泌,改善PCa细胞的生长环境,诱导细胞 分化,使PCa恢复对雄激素的敏感性,从而使内分泌治疗长期有效。 熊果酸对正常培养的LNCaP细胞呈明显的浓度和时间依赖性抑制效应。20 ml的浓度在96 h时对细胞的抑制率接 近50% 。LNCaP细胞在梯度R1881浓度环境中培养,不同的时相点的浓度一生长曲线均呈钟型,曲线的顶点均在0.1 nM处。 可见,正常状况下LNCaP细胞生长的最适R1 881浓度为 0.1 nmmol/L。熊果酸对不同浓度R1881时的LNCaP细胞都有 明显的时间依赖性抑制作用。在熊果酸作用下,LNCaP的 R1881浓度一生长曲线仍保持钟型,但曲线的顶点右移至 1 nmmol/L或略高,即最适R1881浓度上升了10倍以上。LN— CaP细胞存在最适雄激素浓度的机制尚不清楚,有研究认为, EGFR的表达量和活性 j及E2F一1蛋白的表达变化与此有关。熊果酸作用后,LNCaP细胞生长的最适雄激素浓度上升, 对R1881的需求加大,机体内现有的雄激素浓度已不足以维持癌细胞的生长,降低了癌细胞对低浓度雄激素的生存适应能 力,将会阻止或延缓雄激素非依赖性的发生。随着熊果酸作用时间的延长,最适雄激素浓度是否会进一步上升,尚需进一步 观察。 DU145细胞在氟他胺阻断雄激素前后的生长曲线几乎一致,具有明显的不依赖雄激素生长的特性。在雄激素环境下, 熊果酸(20 rn1)在96 h时对DU145细胞的抑制率为 44.4% 。在熊果酸作用的同时再加用氟他胺,同一时间对细胞 的抑制率上升到54.4% ,作用时间延长,抑制率上升的幅度越 大。可见,熊果酸作用后氟他胺阻断雄激素对DU145细胞的生 长发挥了抑制作用,该现象提示,熊果酸在一定程度上诱发了 DU145细胞对雄激素的反应性,为AIPC的治疗和研究提供了 有意义的思路,其内在机制尚须进一步研究。 |