夏枯草果穗熊果酸超临界萃取的研究

夏枯草(Prunella vuIgaris Linn．)为唇形科夏枯草属植物，因“夏至后即枯”得名，是常用传统中药之一，有多种药效。熊果酸是夏枯草中的主要功能成分之一，熊果酸具有抗肿瘤、抗HIV、抗糖尿病、抗菌、抗病毒、增强免疫功能和降血脂等多种生物学活性。如何将夏枯草中熊果酸有效提取出来，是许多研究者关心的问题。目前，熊果酸的提取方法有回流提取法、索氏提取法、冷浸提取法、超声波提取法、超高压提取法和超临界流体萃取法等方法。超临界流体萃取是以一种超临界流体在高于临界温度和压力下从目标物中萃取有效成分、当恢复到常压常温时溶解在流体中成分即以溶于吸收液的液体状态与气态流体分开的提取原料中有效成分的技术，与传统的提取分离法相比，超临界流体萃取的最大优点是在近常温条件下提取分离不同极性、不同沸点的化合物，几乎保留全部有效成分，无有机溶剂残留、产品纯度高、收率高、操作简单、节能。本文以湖南邵阳产的夏枯草果穗为研究对象，采用超临界二氧化碳流体萃取技术，以萃取温度、萃取时间、萃取压力、携带剂为影响因素，以熊果酸提取率为考察指标，研究萃取温度、萃取时间、萃取压力、携带剂对夏枯草果穗中熊果酸提取的影响，优化夏枯草果穗中熊果酸的提取条件。

1材料与方法
1.1材料、仪器与试剂
夏枯草果穗，采于湖南邵阳。 N2000高效液相色谱仪系统 （北京温分分析仪器技术开发有限公司)、超越2000色谱工作站(浙江大学智能信息研究所))、超临界CO₂萃取装置(南通市飞宇石油科技开发有限公司)、TGL-16M高速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、FSJ-1 14植物标本粉碎机(牧渔业扶沟科技仪器厂)．无水乙醇为化学纯；无水甲醇为色谱纯；熊果酸对照品。熊果酸对照品长沙上禾生物科技有售，规格：25%-98%。

1.2对照品溶液的制备
精密称取熊果酸对照品14mg，置10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为1.440mg／ml 的对照品I液．取对照品I液1.0ml置10ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为0.144mg／ml 对照品Ⅱ液．

1.3标准曲线的绘制
分别精密吸取对照品Ⅱ液2.0、5.0、10.0、15.0、 20.0、25.0 ml进样，按下列色谱条件进样测定：色谱柱Nueleosil-CN分析柱(4.6ram×250mm x 50mm)；流动相：无水甲醇；流速：1.0ml／min；检测波长：220nm；柱温：室温．以进样量(x)为横坐标， 峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。
1.4精密度试验
精密吸取对照品Ⅱ液，重复进样5次，测定峰面积，进行精密度试验。
1.5加样回收率实验
精密吸取已测知浓度的供试品溶液500 ml，精密加入熊果酸对照品溶液(1.44mg／m1)100 ml，混匀，进样 l5ul，按样品含量测定方法测定，计算回收率，进行加样回收率实验。
1.6超临界二氧化碳流体萃取工艺流程
将夏枯草果穗洗净于60℃烘烤至干，粉碎，过 60目筛，备用。称取100g夏枯草果穗粉装入500 ml 的不锈钢萃取釜中，开启主泵，达到设置条件，将夏枯草果穗粉静态萃取30 min，再开启小泵动态萃取，萃取完毕后即泻压关机，得到萃取液。

1.7萃取物中熊果酸含量的测定
将所得萃取液除去溶剂干燥后即得萃取粗品，准确称重．将萃取物粗品用甲醇定容于50 ml容量瓶中，用高效液相色谱外标法测定萃取粗品中熊果酸含量，测定条件为：色谱柱：Nueleosil-CN分析柱(4.6mm ×250mm ×50mm)；流动相：无水甲醇；流速：1.0ml／min；检测波长：220nm；柱温：室温；进样量10ul。

2结果与分析
2.1熊果酸对照品标准曲线的绘制
以熊果酸对照品进样量(x)为横坐标，峰面积(Y) 为纵坐标绘制标准曲线， 得回归方程为 Y=220215.0X-7590.60(r=0．9999)，熊果酸的进样量在 0.28～3.60 g范围内与峰面积呈良好的线性关系。2.2精密度试验结果
精密吸取对照品Ⅱ液，重复进样5次，每次5 ul，进行高效液相色谱测定，测定峰面积．结果表明，相对标准差(RSD)为1.34％(n=5)，说明本方法的精密度良好。
2.3加样回收率实验结果
精密吸取已测知浓度(0.162g/l)的供试品溶液500 l，精密加入熊果酸对照品溶液(1．44 mg/m1)100l，混匀，进样15ul，按样品含量测定方法测定，计算回收率．结果表明，平均回收率为 99.45％(RSD=0.81％)。
2.4单因素试验结果
2.4.1携带剂的选择   分别用相同体积(100m1)的甲醇、乙醇、甲醇和乙醇的混合物作携带剂及不加任何携带剂，在萃取温度30％ 、萃取压力20Mpa、萃取时间75min条件下，对夏枯草果穗中熊果酸进行超临界流体萃取，结果可以看出，加携带剂和不加携带剂对萃取效果有明显的影响，加携带剂的萃取效果较好，在携带剂的选择中以甲醇和乙醇的混合物效果较好。
2.4.2携带剂用量对熊果酸提取率的影响    在萃取温度30℃ 、萃取压力20Mpa、萃取时间 75min条件下，分别加入携带剂50、 100、150、20Oml，携带剂用量对熊果酸提取率的影响可以知道，携带剂用量为5Oml时，萃取率较低，携带剂用量为100、150、200ml时，萃取率较高且相近，携带剂用量选择100ml较适宜。
2.4.3萃取时间对熊果酸提取率的影响   在萃取温度30℃、萃取压力20Mpa、携带剂用量1OOml，萃取时间分别为30、45、 60、75、90、105min条件下，萃取时间对熊果酸提取率的影响是萃取率随萃取时间的延长而增大，萃取时间为30、45、60、75min时萃取率较低，萃取时间为90、105 min时，萃取率较高且相近，萃取时间选择90min适宜。
2.4.4萃取温度对熊果酸提取率的影响   在萃取压力20Mpa、萃取时间90min、携带剂用量1OOml，萃取温度分别为15、20、 25、30、35℃条件下，萃取温度对熊果酸提取率的影响是，萃取取温度在l5～30℃范围内，熊果酸萃取率随温度升高增加，30℃熊果酸萃取率最高，超过30℃~C时萃取率下降，萃取温度选择30℃比较适宜。
2.4.5萃取压力对熊果酸提取率的影响   在萃取温度30℃、萃取时间90min、携带剂用量 1OOml，萃取分别为压力10、l5、 20、25、30、35Mpa条件下，萃取压力对熊果酸提取率的影响在萃取压力10Mpa 时，萃取率较低，萃取压力为15Mpa，萃取率较高，萃取压力选择15Mpa比较适宜。
2.5优化提取工艺条件的确定
在单因素的基础上，选用L₉(3³ )进行正交实验，以熊果酸提取率为指标，考察萃取温度、萃取时间、萃取压力、携带剂对熊果酸提取率的影响，极差分析结果可知，A因素(温度)的R值最大，因素的极差越大，说明该因素的变动对结果的影响越大，即A因素((温度)为最重要的因素．根据表3中R值的大小，排列出试验因素的主次顺序： A>D>C>B．正交试验结果即萃取温度 30℃ ，萃取压力15MPa，携带剂甲醇：乙醇=1：1，萃取时间90min．对试验结果进行方差分析和F 检验看出，萃取温度、压力、携带剂、时间对夏枯草果穗熊果酸的萃取有显著影响，其中萃取温度影响最大．
在最佳组合条件下对夏枯草果穗中的熊果酸进行萃取，并进行HPLC分析，超临界CO₂萃取夏枯草果穗熊果酸的效果好，萃取物中的熊果酸含量高，有利于粗提物的进一步分离与纯化．

3 结  论
采用超临界CO₂萃取法萃取夏枯草果穗中的熊果酸，萃取效果好，萃取物中熊果酸含量高，熊果酸提取比较完全．超临界CO₂流体萃取夏枯草果穗熊果酸各因素影响程度为：萃取温度>萃取时间>携带剂>萃取压力．最佳条件为：萃取温度为 30℃ ，萃取压力为15MPa，携带剂甲醇：乙醇=1：1，萃取时间为90min。