熊果酸对胰岛素抵抗大鼠肝脏组织PTP-1B、IRS-2mRNA表达的影响
熊果酸是存在于天然植物中的一种三萜类化合物.在酸味中药如山茱萸、山楂、乌梅、五味子中含量丰富,具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、降血脂等多种药理活性。近年来国内外均有文献报道熊果酸能够增加胰岛素的敏感性,降低血糖 本实验用熊果酸对胰岛素抵抗模型大鼠进行干预,观察其对肝脏组织蛋白酪氨酸磷酸酯酶-lB (PTP-1B)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)mRNA表达的影响,探讨其改善胰岛素抵抗的分子机制。
关键词:熊果酸 胰岛素 PTP-1B
1 材料与方法 1.1 药物、试剂与仪器 熊果酸(长沙上禾生物科技有限公司有售),纯度>98% ,以含5g/L 羧甲基纤维素钠的PBS溶液(pH7.4)分别配制成含熊果酸 50g/L、25g/L的混悬液;盐酸二甲双胍片购于上海信谊制药总厂,采用水磨法,以含5g/L 羧甲基纤维素钠的PBS溶液配制成含二甲双胍33g/L 的混悬液; BIO-RAD CareSens血糖仪、试纸购于韩国i-SENS公司:胰岛素ELISA试剂盒购于上海达为科生物科技有限公司;DEPC处理水; 氯仿(HPLC级; 焦碳酸二乙酯 ,购于上海生物工程技术公司;TriZO1试剂盒:SYBR Green PCR试剂盒:Real-time PCR检测仪ABI-7500。
1.2 模型制备、动物分组及给药 8周龄清洁级雄性健康 Wistar大鼠6O只.体重180~200g。先适应性喂养1周后.随机抽取l2只设为正常组.剩下的48只大鼠为模型组正常组饲以基础饲料.由第二军医大学实验动物中心提供,模型组饲以高脂饲料:基础饲料(78.9g)基础上加猪油10g、胆固醇lg、蛋黄粉lOg、胆盐0.1g,模型组大鼠高脂喂养9周后.将大鼠按体质量随机分组.每组12只,分为熊果酸高、低剂量组,分别按300mg/(kg·d)~、150mg/(kg·d) 的剂量灌上述熊果酸混悬液:二甲双胍组,按200mg/(kg.d)-1的剂量灌上述二甲双胍混悬液:正常对照组和模型对照组.灌等体积含5g/L--羧甲基纤维素钠的PBS溶液:除正常组饲以基础饲料.其他各组给药同时继续高脂饲料喂养.所有大鼠均全程自由饮水
1.3 指标检测及方法 药物干预第4 周、8周后.各组分别按体质量随机取6 只大鼠.禁食6h.乙醚麻醉下眼眶静脉取血.分离血清.低温保存待检 动物断颈处死后迅速取出肝脏称取肝湿重.在每只大鼠同一肝叶和部位切取小块组织.置入10% 甲醛缓冲液中固定:再取同一肝叶和部位的肝组织2~4块置人冻存管于-80℃保存
l.3.1 一般情况 观察各组大鼠饮食行为、精神、活动状态、毛发等情况。 1-3.2 空腹血糖、血清胰岛素、胰岛素敏感指数及血脂测定 以禁食6h (7:00AM-13:00PM)血糖及疵清胰岛素水平定为空腹血糖(FBG)和空腹胰岛素fFINS)水平.血糖水平采用微量血糖仪测定:胰岛素水平运用酶联免疫吸附法(ELISA)测定;胰岛素敏感指数 (ISI)用李氏法计算.即ISI=1n 1/(空腹胰岛素浓度X空腹血糖浓度)]:ff『L清血脂:包括TC、LDL-C.采用全自动生化分析仪测定. 1.3.2 肝脏指数测定 称取肝脏湿重(LW).并计算肝脏指数 (LI).LI=肝重/体重XlO0% 1.3.3 病理学检查石蜡切片.HE染色.光镜下观察肝脏组织的脂肪变性、纤维化及炎症等病理变化 1.3.4 肝脏P1rP-1B、IRS-2mRNA 测定 用Real-time PCR 法检测肝脏PTP-1B、IRS-2mRNA 按Triz0l试剂盒说明书提取肝脏组织总RNA 上下游引物由上海达为科生物科技公司合成。P1-1B上游引物:5"-ACC CTG TGC GGA AAT GCG GG-3 :下游引物:5"-GGC AGT CAG TCA ACC CCG GC-3/0 IRS-2上游弓l物:5 -TGC GAA CAG CCG TCG GTG AC-3 :下游引物:5"-GAC CGG TGA CGG CTG AAC GG一3 GAPDH 上游引物:5"-AGA ACA TCA TCC CTG CAT CC-3 :下游引物:5"-TGG ATA CAT TGG GGG TAG GA-3 反转录后行实时荧光定量PCR。mRNA相对表达量:2 zcrx100%.ACT=目标基因CT值一内参(GAPDH)CT值
1.4 统计学方法所有数据分析采用SPSS13.0统计软件处理。多样本统计采用单因素方差分析。 P 2 结果 2.1 一般情况正常组大鼠精神状态良好、饮食正常、精力充沛。皮毛整洁;模型组大鼠精神萎靡,懒惰,性情较温顺,皮毛凌乱欠光泽:用药组均有不同程度的饮食和活动减少.皮毛欠光泽. 2.2 大鼠FBG、FINS、胰岛素敏感指(ISI1、血脂的变化 熊果酸对大鼠FBG无明显影响.各组间比较差异无显著性 (P>0.05):与同期模型组大鼠比较治疗组FINS显著降低.ISI升高,TC、LDL-C降低,差异有统计学意义(P<0.05或 P<0.01).提示熊果酸能够明显改善IR , 2-3 大鼠体重、肝脏指数的变化 高脂饮食可致IR模型大鼠的体重、肝质量增加,肝脏指数明显升高;熊果酸和二甲双胍均能明显降低IR模型大鼠的体重及肝指数(P<0.01或 P<0.05)。详见表2。 2.4 肝脏病理学观察 2.4.1 解剖观察正常组大鼠肝脏呈鲜红色。边缘比较锐利.表面光滑。模型组肝脏体积明显增大,边缘变钝,呈土黄色.质软,切面有油腻感,呈典型脂肪肝外观:用药组部分肝脏接近正常,肝脏体积稍大,表面呈浅黄色,油腻感减轻。 2.4.2 光镜观察正常对照组大鼠肝组织形态学未见明显异常:模型组大鼠呈重度肝细胞脂肪变性.肝细胞浆内出现大小不等的脂肪空泡,有些肝细胞充满脂肪,胞核消失.整个细胞变成大的空泡部分肝细胞溶解坏死.肝细胞问见少量炎性细胞浸润,有轻微纤维化改变:用药组肝脏病理呈不同程度的改善,以轻度至中度脂肪变性为主.脂肪变肝细胞数目减少.肝细胞形态大致正常,胞浆内脂滴减少或消失,胞浆丰富.无或偶见少量炎性细胞浸润.无纤维化改变。见图1 图2 2.5 肝组织PTP-1B、IRS-2mRNA表达 正常组肝组织IRS-2mRNA 呈高水平表达.PTP-lBmRNA呈低水平表达:模型组肝组织 IRS-2mRNA 呈低水平表达.PTP-1BmRNA呈高水平表达:熊果酸及二甲双胍均可不同程度增加IRS-2mRNA 的表达.降低PTP-1BmRNA表达 差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)
3 讨论 肝脏是胰岛素(Ins)作用的主要靶器官.肝脏IR时主要表现为Ins与受体结合后信号转导到细胞内引起的一系列代谢过程受到阻碍.呈现出 Ins反应性降低 发生在胰岛素受体底物(IRS1蛋白分子水平上的IR是常见的一种.IRS基因表达的降低、蛋白量的减少及功能障碍都会影响Ins信号的有效传递而导致IR 胰岛素受体底物-2(IRS~2)主要在肝脏和胰岛B 细胞表达.IRS-2基因缺乏的小鼠出现外周IR和代偿性Ins分泌不足.提示IRS~2蛋白是联系外周IR 和B细胞功能缺陷的重要介质 IRS-2主要通过类醇渊节元件结合蛋白 (SREBP)调控脂质合成.IRS-2下凋可影响其下游PI3K/Akt信号转导.导致肝糖原合成减少.脂肪合成增加.提示肝细胞的脂肪变与肝脏IR 密切相关l61 P~1B能与胰岛素受体、IRS 等信号蛋白作用.使这些蛋白调节区的酪氨酸残基去磷酸化.阻断Ins信号级联反应的下传在糖尿病动物模型的肝脏和骨骼肌中降低PTP-1B的表达水平.可增加胰岛素受体及其底物的酪氨酸磷酸化水平。增强 Ins信号转导.提高对Ins的应答 本研究结果发现.熊果酸能够降低高脂饮食诱导的IR 大鼠体重、H-F脏指数.改善脂质代谢及肝脏脂肪变性,降低空腹m清Ins.增加Ins敏感性,作用效果和二甲双胍相似.高、低剂量组之间未发现明显的量效关系。其作用机制可能与熊果酸抑制PTP-1BmRNA表达从而上调IRS-2mRNA表达有关中医中药复方及单味药在改善IR方面均有一定优势和潜力,具有多环节、多靶点、且作用相对安全的特点I8删 IR涉及多个系统的疾病.如糖耐量减低或糖尿病、肥胖、高脂血症、脂肪肝、高血压、冠心病等,且往往m现在疾病的早期阶段。因此,在IR早期.及时、长期进行干预预防和治疗以减缓或逆转 IR.可以体现中医中药的优势。
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