厚朴超临界CO2提取工艺优化及提取物抗氧化活性研究 | 厚朴超临界CO2提取工艺优化及提取物抗氧化活性研究 |
| 发布时间:2020-08-26 信息来源:admin 发布人:admin 点击次数:642 |
摘 要：目的 优选超临界CO2提取厚朴有效成分的工艺并探讨厚朴超临界CO2提取物的抗氧化活性。方法 采用HPLC法测定厚朴超临界CO2提取物中厚朴酚与和厚朴酚的含量，正交试验优选厚朴超临界CO2提取工艺，MTT法检测提取物抗氧化活性。结果 厚朴酚优化工艺为萃取压力25MPa，萃取温度55 ℃，CO2用量30 kg；和厚朴酚最佳提取工艺压力15 MPa、萃取温度50 ℃、CO2用量25 kg。厚朴超临界CO2提取物具有抗氧化活性，且分离参数不同，抗氧化活性有显著差异。结论 在所优选的提取工艺条件下，厚朴酚、和厚朴酚的提取效率较高，重复性较好，工艺稳定可行，提取物具有良好的抗氧化活性。 厚朴首见于《神农本草经》，为木兰科木兰属植物厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Wils.或凹叶厚朴M. officinalis Rehd. et Wils. var. bilobaRehd. et Wils. 的干燥干皮、根皮及枝皮[1]，主要分布在我国长江流域[2]，为国家二级保护植物，是我国特有的、常见的大宗中药材[3]。厚朴性温，味苦、辛，入脾、胃、肺、大肠经，具有燥湿消痰、下气除满的功能[4]，用于湿阻脾胃、脘腹胀满、气滞胸腹胀痛、便秘腹胀、痰多咳嗽等症[5]。现代研究表明，厚朴的化学成分主要有木脂素类、挥发油类、生物碱类[6]，木脂素类成分是厚朴中最丰富的一类化学成分[7]，迄今已分离出厚朴酚、和厚朴酚、和厚朴新酚、6′-O-甲基和厚朴酚等20多种化合物[8]，其主要有效活性成分为厚朴酚及和厚朴酚，厚朴酚具有抗炎、抗菌、抗哮喘、抗溃疡、抗氧化、抗肿瘤、激素调节等药理作用[9-12]，还可用于糖尿病、神经系统疾病、胃肠道疾病的治疗；和厚朴酚具有抗白内障、抗血管新生、抗肿瘤、抗惊厥、抗癫痫、神经保护、抗菌等作用[10-11]，也可用于心血管疾病及糖尿病的治疗。 厚朴的常规提取方法多采用乙醇回流提取、碱提、超声辅助提取等[13-14]。随着提取技术的创新与发展，超临界流体萃取作为一种新型分离技术，其具有高效且选择性好[15-17]、较低温度下提取对热敏性物料影响小、对易氧化成分的影响小[18]等一系列优点，特别对于含氧化合物、生物碱等成分提取分离效果好[19]，可在很大程度上避免传统提取工艺效率低、有机溶剂残留、资源浪费等缺陷。已有研究表明超临界流体萃取厚朴成分的效率是传统醇回流法的数倍之多[20]。同时厚朴酚与和厚朴酚二者互为异构体，均为脂溶性成分，适合采用超临界CO2萃取，本实验尝试优化厚朴超临界CO2提取工艺，并探讨其提取物的体外抗氧化活性，以期为厚朴资源的合理利用奠定基础。 1 仪器与试药 1.1 仪器 HL-CQE3L/50MPa-IIC型超临界CO2萃取装置，杭州华黎泵业有限公司；2200型中药材粉碎机，常州五谷农场食品有限公司；SPD-16高效液相色谱仪，紫外-可见检测器，岛津仪器有限公司；UV-9100型紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；SB-5200 DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；New Classic MF天平，Mettler Toledo公司；DGF-4AB型立式电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；EKUP-II-20T型超纯水系统，长沙市科临电子科技有限公司；SHEL-LAB CO2培养箱，美国Sheldon Manufacturing公司；Varioskan Flash酶联免疫检测仪，美国Thermo Scientific公司；Microfuge 20R高速冷冻离心机，德国Beckman Coulter公司。 1.2 试药 厚朴饮片购自湖南福泰中药饮片有限公司，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为木兰科木兰属植物凹叶厚朴Magnolia officinalis Rehd. etWils. var. biloba Rehd. et Wils.(MOB) 的干燥干皮、根皮及 枝皮。对照品厚朴酚（批号KS0912CB14）、和厚朴酚（批号28O6B5149），质量分数均≥98%，上海源叶生物科技有限公司；MTT，批号M2128，美国Sigma公司；DMEM高糖培养基，AB216498，美国Hyclone公司；30%的过氧化氢溶液，批号F1825154，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜为分析纯；甲醇为进口色谱纯，Tedia公司；蒸馏水为二次重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil® C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（70∶30）；检测波长294 nm；柱温30 ℃；体积流量1 mL/min；进样量10 μL；在此色谱条件下，厚朴酚、和厚朴酚分离度均大于1.5，理论塔板数按厚朴酚峰计算不低于3 800。 2.2 对照品及供试品溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取厚朴酚对照品2.01 mg、和厚朴酚对照品2.32 mg，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成含厚朴酚80.40 μg/mL与和厚朴酚92.80 μg/mL混合对照品溶液。 2.2.2 供试品溶液的制备 厚朴饮片粉碎，过40目筛，置于60 ℃的烘箱中烘干后装入料筒，置入超临界CO2萃取装置进行提取，收集分离釜1和2的提取物并均匀混合，精密称取提取物适量，置于25 mL量瓶中，加甲醇使之溶解并稀释至刻度，超声5 min，静置，过0.45 μm的微孔滤膜，即得供试品溶液。 2.3 HPLC分析方法学考察 2.3.1 色谱条件的选择 分别采用甲醇-水的不同配比（78∶22、70∶30、65∶35）进行筛选，在甲醇-水（70∶30）的流动相比例下目标峰不受其他杂质峰的干扰，峰形对称。用紫外分光光度计测定厚朴酚对照品的吸光度，确定检测波长294 nm。在上述色谱条件下，和厚朴酚、厚朴酚分离良好，保留时间分别为8.4、11.2 min。色谱图见图1。 2.3.2 标准曲线的制备 分别精密吸取厚朴酚与和厚朴酚对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，制成不同质量浓度梯度的系列对照品溶液，按“2.3.1”项下方法进样10 μL测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y）、质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程，厚朴酚的线性回归方程分别为Y＝12 554.8 X＋30 696.6，r＝0.999 3；和厚朴酚为Y＝16 703.9 X＋70 459.8，r＝0.999 1；结果表明，厚朴酚与和厚朴酚进样质量浓度分别在8.04～80.4 μg/mL和9.28～92.8 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。 2.3.3 精密度试验 分别取厚朴酚、和厚朴酚对照品溶液各10 μL，依法连续进样6次，测定峰面积，结果厚朴酚与和厚朴酚峰面积的RSD分别为2.41%和1.86%，表明仪器精密度良好。 2.3.4 重复性试验 取厚朴饮片按“2.2.2”项下方法平行配制6份，进样测定样品中厚朴酚与和厚朴酚的含量，结果表明厚朴酚与和厚朴酚质量分数的RSD分别为2.62%、2.78%，说明所建立的分析方法重复性较好。 2.3.5 稳定性试验 精密吸取“2.3.4”项重复性试验1号供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h时测定峰面积。结果厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD分别为1.63%和2.13%，表明所配制的供试品溶液在24 h内稳定性良好。 2.3.6 加样回收率试验 精密称取6份已测定厚朴酚与和厚朴酚含量的厚朴粗提取物，置于5 mL量瓶中，每份精密加入取厚朴酚与和厚朴酚对照品溶液各1 mL，加甲醇至近刻度线，摇匀，超声30 min，放冷后定容至刻度线，微孔滤膜滤过。按“2.3.1”项下色谱条件测定，分别计算加样回收率，结果厚朴酚与和厚朴酚的平均加样回收率分别为99.15%、99.07%，RSD分别为2.06%、3.10%。 2.4 正交试验 2.4.1 正交试验结果及分析 超临界流体萃取过程受多种因素影响，如萃取目标成分本身性质、超临界流体的状态、溶剂用量、提取时间等。作为连续流加溶剂的萃取过程，超临界CO2萃取过程温度低且在CO2保护下进行，可有效降低目标组分的氧化破坏和组分之间的化学反应，而提取过程中提取时间受CO2体积流量的影响很大，但因萃取过程中CO2的状态不断改变，故提取过程中CO2体积流量并不稳定，因此以CO2用量作为一个考察因素。根据前期试验初步筛选结果选择萃取压力（A）、萃取温度（B）、CO2用量（C）3因素，选用L9(34)因素水平表进行正交试验，每个试验号平行2次，取平均值。以厚朴粗提取率（Y1，Y1＝提取物质量/厚朴量）、厚朴酚提取量（Y2，Y2＝提取物中厚朴酚质量/厚朴量）、和厚朴酚提取量（Y3，Y3＝提取物中和厚朴酚质量/厚朴量）、厚朴酚与和厚朴酚总提取量（Y4，Y4＝Y2＋Y3）为评价指标。因素水平及正交试验结果见表1，极差分析结果见表2，方差分析结果见表3。 由表2、3结果可知，对于厚朴粗提取率及以厚朴酚提取量为优化目标的优化工艺均为A3B3C2，即萃取压力25 MPa，萃取温度55 ℃，CO2用量30 kg，其中压力对其影响最大，温度影响最小。压力越大，超临界流体的密度越大，则溶解能力越强，温度越高，超临界流体的黏度降低，则扩散能力越强，这符合超临界CO2萃取的基本规律，但考虑到生产成本、工业化生产的实施以及对药材中热敏性物料的保护等问题，未继续考察进一步升高压力和温度所带来的影响，以A3B3C2为优化提取工艺。 对于以单位质量生药材的和厚朴酚提取量为优化目标所获得的优化工艺为A1B2C1，即萃取压力15 MPa，萃取温度50 ℃，CO2用量25 kg，其中CO2用量对其影响最大，压力影响最小。此外，对于厚朴酚与和厚朴酚总提取量为指标的最终优化工艺亦同厚朴酚提取优化工艺，这源于提取物中厚朴酚的含量要比和厚朴酚大近1倍，这也符合文献报道[21]的超临界CO2萃取厚朴提取物中的成分分布， 因此，提取物中以厚朴酚为主导，体现出与厚朴酚相同的提取工艺参数。 2.4.2 验证试验 分别以厚朴酚与和厚朴酚最优提取工艺为条件，以厚朴酚质量分数与和厚朴酚质量分数为指标，厚朴酚：萃取压力控制在25 MPa，萃取温度为55 ℃，CO2用量是30 kg；和厚朴酚：萃取压力控制在15 MPa，萃取温度为50 ℃，CO2用量是25 kg。分别进行3次重复试验，测定厚朴酚与和厚朴酚含量，计算出厚朴提取物中厚朴酚的质量分数分别为38.21%、39.56%、40.04%，平均质量分数为39.37%，RSD为2.57%；和厚朴酚质量分数分别为12.28%、12.71%、12.30%，平均质量分数为12.43%，RSD为2.0%。结果表明，在优选出的提取工艺条件下，厚朴酚、和厚朴酚的提取效率较高，重复性较好，工艺稳定可行。 2.5 MTT法检测抗氧化活性 将人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞按8×103个/孔接种于96孔板，置于RPMI1640培养基（含10%胎牛血清、青霉素和链霉素100 kU/L）中，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h后，分空白对照组、正常对照组、H2O2干预（模型）组以及6组药物组，每组设5个平行复孔，实验重复3次，空白组与模型组加等量培养基，各给药组加相应浓度的含药培养基预先干预2h后，模型组与药物组加入400μmol/L的H2O2诱导2 h后，每孔加入MTT溶液，继续培养4 h后取出96孔板，PBS冲洗3遍，加入DMSO，摇床上低速振荡10 min，采用酶联免疫检测仪测定490 nm处的吸光度（A）值[22]。为揭示不同分离条件下厚朴提取物的抗氧化活性差异，分离釜1以10 MPa、40 ℃分离得样品1，分离釜2以5 MPa、35 ℃分离得样品2，分别用DMSO将样品1和样品2制成0.125、0.25、0.75、1、2、5 mg/mL 6个不同质量浓度梯度的厚朴提取物溶液，分别进行细胞实验，测定490 nm处的A值，计算厚朴超临界CO2提取物对H2O2致SH-SY5Y细胞氧化损伤的抑制率，结果见图2。 抑制率＝(A模型－A药物)/(A模型－A空白) 由图2可知，样品1和2对H2O2致SH-SY5Y细胞氧化损伤的抑制率存在明显差别，说明超临界流体萃取过程中不同的分离压力和温度获得的产物有效成分存在明显差别，样品1获得的厚朴提取物随着质量浓度上升，其抑制率升高，0.25 mg/mL时最大，达85.80%，进一步增大其质量浓度，则抑制率明显降低，当样品质量浓度增大至5 mg/mL时，出现了抑制率为负的情况。说明在此质量浓度时，提取物具有抑制肿瘤细胞生长的作用，呈现出细胞毒性。样品2获得的厚朴提取物则呈现出相对较温和的抗氧化作用，其细胞毒性相对较弱，除质量浓度为5 mg/mL时抑制率降低至47.64%外，其他质量浓度样品的抑制率均在70%以上。 3 结论 厚朴入药已有2 000多年的历史，传统提取工艺采用有机溶剂回流提取，多项研究发现超临界二氧化碳萃取技术效率高于传统提取[23-24]，SFE-CO2提取厚朴成分效率理应更高，对厚朴多种提取方法比较的研究[25]结果表明采用SFE-CO2工艺提取量最高。相较于传统提取工艺，SFE-CO2具有一系列优势，尤其是其绿色环保方面优势明显。可通过调整提取分离的压力和温度获得不同的目标产物。正交实验优化结果提示，对同一味中药，提取及分离工艺变化，目标组分不同。因此，优化提取工艺需依据目标组分的性质进行筛选，实验结果还表明。超临界CO2萃取的工艺参数不但会影响到提取效率，还会影响提取产物的化学成分，这也符合超临界CO2萃取过程中可以通过萃取及分离温度、压力的改变以调整其溶解能力的基本原理。同时，也提示可以根据所要提取目标组分的性质优化提取及分离参数。在本研究的基础上，可进一步采用加入不同极性的溶剂作为夹带剂可将厚朴中的组分按不同极性段进行提取、分离，为中药提取过程优化提供参考，并为中药药效成分活性实验提供基础。亦可根据中药药效成分活性实验结果，针对性地设计提取及分离工艺过程，以获得目标明确、作用确切的中药活性成分。 厚朴超临界CO2提取物抗氧化活性细胞实验结果表明，厚朴超临界CO2提取物具有明显的抗氧化活性，但受浓度影响也可能具有一定的抑制细胞生长的作用，这也符合厚朴酚、和厚朴酚抗肿瘤的药理作用[26]。同时对于2种不同提取工艺条件得到的提取物呈现不同的抑制率，可认为随着分离压力及分离温度的变化，SFE-CO2的溶解能力和黏度均会发生较大变化，因此，样品1、2化学成分与含量差异明显，故存在较大的活性差异。根据相关文献报道[27]，其超临界提取物主要为厚朴酚、和厚朴酚、magnaldehyde B、lignans、crytomeridiol，该结果亦提示在后续研究过程中可以根据活性需要针对目标成分的性质筛选合适的分离工艺。但其具体作用物质、质量浓度及机制有待于进一步研究阐明。此外，即使是在同一工艺参数下提取获得的提取物，分离过程的工艺参数对所获得的成分类别影响巨大，不同分离参数下获得的产物呈现出截然不同的药物效应，因此在超临界流体提取工艺优化过程中，应根据目标组分的性质，合理设计提取、分离的工艺参数，才能真正发挥超临界流体萃取提取分离的优势，为阐明中药药效物质及其作用机制提供支撑。
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